Поколение Органосохраняющие условных СМИ и приложений для изучения органоспецифической Влияния на рак молочной железы метастатическое поведение

Резюме

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Аннотация

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Введение

Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемых рака у женщин и второе место среди причин , связанных с раком смертей ^1. высокий уровень смертности от рака молочной железы является, главным образом, из-за отказа от традиционной терапии для смягчения и ликвидации метастазами; приблизительно 90% случаев смерти от онкологических заболеваний обусловлены метастазирования ^2. Понимание основных молекулярных механизмов метастатического каскада имеет первостепенное значение для разработки эффективных терапевтических средств, как в раннем и рака молочной железы на поздней стадии.

Прошлые исследования помогли выяснить многоступенчатый характер метастазирования рака молочной железы , и он выдвинул гипотезу о том , что исход как прогрессии рака и метастазов во многом зависит от взаимодействия между раковыми клетками и принимающей среды ^3. Клинические наблюдения показывают , что многие виды рака органа отображения тропизм, то есть., Склонность к метастазированию преимущественно к конкретным organs.In КАНе рака молочной железы, болезни пациента , как правило , распространяется или метастазирует 5 основных сайтов, в том числе кости, легких, лимфатических узлов, печени и головного мозга ^4-6. Многие теории были разработаны, чтобы объяснить этот процесс, но лишь немногие из них выдержали испытание временем. Теория Юинга метастазирования, предложенный в 1920-х годах, выдвинул гипотезу thatthe распространение метастаз строго из-за механических факторов; в результате чего опухолевые клетки разносятся по всему телу нормальных определенных закономерностей физиологического кровотока и просто арестовывают в первом капиллярного ложа они сталкиваются с ^7. В отличие от 1889 года "семена и почва" гипотеза Стивена Педжета предположил, что дополнительные молекулярные взаимодействия были ответственны за выживание и рост метастазов, в результате чего раковые клетки ( "семена") могут только утвердиться и proliferatein микросреды органов, которые производят соответствующие молекулярные факторы ( "почвы ") ^8. Почти столетие спустя, Леонард Вайсс подвзял мета-анализ ранее опубликованных данных аутопсии и подтвердили предсказание Юинга, что многие метастатические опухоли, обнаруженные во время вскрытия были найдены в ожидаемых пропорциях, которые можно было бы ожидать, если метастатической тропизм орган был определен узорами кровотока в одиночку. Тем не менее, в manyinstances были сформированы на определенных участках , то можно было бы ожидать от предложенных механических факторов Юинга ⁹ меньше или больше метастаз. Эти счета и теории говорят о том, что специфические микросреды органа играют решающую роль в моделях распространения и последующего роста и выживания многих видов рака, включая рак молочной железы.

Прошедшие исследовательские усилия в основном сосредоточены на опухолевых клеток , полученных факторов и их вклад в тропности органов наблюдается в метастазирования рака молочной железы ^10-12, однако мало исследований изучены факторы , полученные из микросреды органа , который может обеспечить благоприятную нишу для созданияот метастазов рака молочной железы. Во многом это связано с техническими проблемами изучения компонентов микросреды органа в пробирке.

Настоящая статья описывает всеобъемлющую систему исключая виво модель для изучения влияния растворимых компонентов лимфатических узлов, костей, легких и головного мозга на метастатической поведение клеток рака молочной железы человека. Предыдущие исследования подтверждены этой модельной системе, продемонстрировав , что различные клеточные линии рака молочной железы отображать линии клеток и специфический органоспецифический злокачественную поведение в ответ на орган-кондиционированной среды , что соответствует их в естественных условиях метастатического потенциала ^13. Эта система модель может быть использована для выявления и оценки конкретных органов, полученных растворимые факторы, которые могут играть определенную роль в метастатической поведении рака молочной железы и других видов раковых клеток, в том числе факторов, влияющих на рост, миграция, стволовой как поведение и экспрессию генов, а также идентификациипотенциальные новые терапевтические мишени для рака. Это первая система естественных условиях модель ех , которая может быть использована для изучения органоспецифической метастатическое поведение в деталях и оценить роль органов , полученных растворимых факторов в продвижении процесса метастазирования рака.

протокол

Все исследования на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными, в соответствии с протоколами, утвержденными Западного Университета использования животных подкомитета.

1. Выделение органов (легких, мозга, костей, лимфатических узлов)

1. Подготавливают четыре стерильных 50 мл конические пробирки (по одному для каждого органа должны быть изолированы), содержащий приблизительно 30 мл стерильного фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Предварительно взвешивают каждую пробирку PBS с помощью электронного баланса.
2. Эвтаназии 6-12 недель старая мышь с помощью CO ₂ ингаляции. Мыши должны быть оставлены в камере СО ₂ в течение приблизительно 1 - 2 мин или пока мышь перестает двигаться и дышать. Успешное эвтаназии может быть дополнительно подтверждено отсутствие пульса при проверке вручную с помощью пальца. Избегайте шейки дислокации, как этот метод может привести к разрыву кровеносных сосудов шеи, приводящей к сложности удаления подмышечных лимфатических узлов.
   Примечание: Предыдущая работа специально используетсяздоровых самок голых мышей, Hsd: бестимусной Nude- Foxn1 ^{ню 13.}
3. В стерильной капот культуры ткани, поместите курсор на его спине на поролоновую подкладку полистирола, распространение конечности и использовать булавки, чтобы держать их на месте.
4. С помощью стерильного пинцета и ножниц, перерезал кожи живота на срединной линии на гениталии и разрезают вверх по направлению ко рту. Аккуратно оттяните кожи живота от мышц живота и пин-код на своем месте на пенополистирола площадку.
5. Найдите подмышечные, плечевой и паховые лимфатические узлы.
   Примечание: Лимфатические узлы обычно окружены жировой тканью. Паховых лимфатических узлов легче всего обнаружить, поскольку они встречаются поверхностно на стыке двух кровеносных сосудов на отстранился кожу живота. Подмышечные и плечевая лимфатические узлы расположены глубже в ткани и требуют нежную маневрирование ткани.
   1. После того как вы расположены лимфатические узлы, не используйте ножницы, чтобы мягко и осторожно разрезал лимфы нетдез от кожи, жира и сосудов и удалить их с помощью мыши. Для того, чтобы подтвердить правильность рассечение, раскатать пинцетом над удаленной ткани. Если жесткий комок существует при прокатке пинцетом над тканью, то лимфоузел, скорее всего, был успешно удален.
   2. Поместите удаленные лимфатические узлы в охлажденный льдом PBS.
6. С помощью пинцета и ножниц, откройте брюшной полости путем разрезания через открытую брюшную стенку в движении вверх по направлению к грудной клетке. Осторожно прорезать грудины, обнажая грудную полость.
7. Найдите диафрагму ниже легкие и разрезают диафрагму. Она должна оттянуть ребер из-за напряженности.
8. Поднимите легкие снизу и перерезали основной ткани в сторону трахеи. Это позволяет легкие быть свободно удалены из грудной полости. Удалить сердце и легкие единым блоком и место в охлажденный льдом PBS. Сердце может быть удалена из легких здесь или как раз перед взвешиванием на шаге 2.
9. Удалитьбулавки, держа мышь в месте на пенополистирола площадку. Переверните мышь и разрезают кожу нижней части спины на всем пути через дорогу от фланга на фланг.
10. Используя стерильный кусок марли, чтобы держать туловище мыши, очистить кожу спины мыши над ног и ступней мыши.
11. Используя тот же кусок стерильной марли, держать нижнюю часть ноги на месте, тщательно сломать голеностопный сустав стопы мыши и очистить кожу над суставом проксимально в сторону коленного сустава.
12. Используя ножницы, удалите берцовую кость, свободную от коленного сустава и место в охлажденный льдом PBS.
13. Повторите шаги 1.11) до 1.12) с противоположной конечности.
14. Использование щипцов, удерживая бедренной кости в месте, срежьте окружающих мышечной ткани с помощью ножниц и удаления бедренной кости, помещая его в охлажденном льдом PBS.
15. Повторите шаг 1.14) с противоположной конечности.
16. Используя новый кусок стерильной марли, держать голову мыши на месте. С помощью пинцета и ножниц, аккуратно снять кожу, чтобы выставить SКулл. С помощью ножниц, аккуратно вырезать затылочной череп от верхней центральной в прямой и нисходящей линии, чтобы выставить задний мозг.
17. Использование щипцов, совка под мозгом по отношению к передней и удалить весь мозг. Поместите мозг в охлажденный льдом PBS.
18. Повторите 1.1) до 1.17) шагов, по крайней мере, четырех мышей.

2. Орган взвешивания

1. После выделения органа, взвешивать каждую пробирку, содержащую PBS легких и мозговой ткани с помощью электронного баланса.
2. Вычислить разность веса путем вычитания веса предварительной изоляции (только PBS), от веса трубы PBS + органов (легких и головного мозга).
3. Определить количество медиакритериев для ресуспендирования фрагментов тканей из вычисленной разности веса.
   Примечание: легких и ткани головного мозга являются вес нормализуется ресуспендирования в 4: 1 СМИ: соотношение ткани (объем / вес).

3. Генерация Lung- и кондиционированной среды мозгового

1. В стерильную тпроблема культуры капот, инвертировать PBS пробирки, содержащие легкие или мозг в три раза, чтобы удалить остатки крови из органов и аспирата PBS, содержащих кровь. Повторите со свежим холодным PBS, пока раствор не становится ясно, без признаков крови.
2. Поместите легкие и мозг в отдельных 60 мм ² стеклянные чашки Петри. С помощью двух стерильным скальпелем лезвия, фарша легкие или мозги, неоднократно нарезка взад и вперед до тех пор , пока фрагменты ткани примерно ~ 1 мм ³ размера.
3. фрагменты Ресуспендируют ткани в соответствующем объеме (определено ранее на шаге 2.3) Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM): F12, дополненной 1х концентрированный митоген добавку и пенициллином (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл).
4. Добавить ресуспендировали в легких или ткани головного мозга фрагментов в одну лунку 6-луночного планшета.
5. Инкубируйте фрагментов тканей в средствах массовой информации в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO _2. После инкубации собирают кондиционированная среда для каждой ткани и Further разбавить, добавив три эквивалентные объемы свежей среды в 50 мл коническую трубку.
6. Центрифуга при 1000 х г в разбавленном кондиционированной среды для каждого органа при температуре 4 ° С в течение 15 мин для удаления крупного мусора ткани. Сбор средств массовой супернатант и фильтруют через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
7. Бассейн кондиционером средств массовой информации из каждого органа (то есть., Легких с легких и головного мозга с мозгом) из нескольких мышей для учета мыши к мыши изменчивости. Аликвоты и хранят кондиционированная среда при температуре -80 ° С до использования.

4. Генерация костного мозга кондиционированной среды

1. В стерильной культуре ткани капот, обрезать лишнюю ткань от кости и удалить эпифизов (концевые части) из костей с помощью ножниц.
2. С помощью 27 ½ G иглы заподлицо костномозговой полости кости, нажав 1 мл PBS, через центр каждой кости. Это позволит вам собрать стромальных клеток костного мозга (СККМ) в свежую пробирку, содержащую PBS.
3. Центрифуга на 1,000 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С и промыть BMSC дважды PBS. Ресуспендируют костного мозга стромальные клетки в 20 мл среды роста костей стромальных клеток (DMEM: F12, дополненной 1х концентрированный митоген добавку, пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл) и 10% фетальной Бовену сыворотки (FBS) ).
4. Пластина 10 мл ресуспендировали стромальных клеток костного мозга в одной колбе Т75.
   Примечание: Комбинирование и клетки пластины из каждых 2-х мышей в каждой колбе T75; для четырех мышей, два T75 колбах необходимы (приблизительно 1 × 10 ⁷ клеток / колбу).
5. Выдержите кости стромальные клетки костного мозга в костном стромы средах роста клеток в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% СО _2. После инкубации удалить жидкость с обеих колбах Т75 и положить в новую колбу Т75, маркировать эту колбу, как "Летун Термос". Добавить свежую кость стромы СМИ роста клеток с предыдущими 2 колбах и инкубировать все 3 колбы при 37 ° С и 5% CO _2.
6. После того, как клетки достигают примерно 70% сплошности (приблизительно 5 - 7дней) прохождение клетки. Чтобы сделать это, удалить средних и мыть клетки дважды PBS (3 мл каждого мытья). Удалить PBS и добавляют 3 мл трипсина / EDTA раствора, гарантируя, что трипсин покрывает всю поверхность колбы. После того, как клетки отрываться колбу (~ 2 - 3 мин), прекратить трипсином реакцию добавлением 3 мл костного стромальных клеток питательной среды). Центрифуга 900 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С, отказаться от средств массовой информации и ресуспендирования клеток в 10 мл свежей костной стромы сред роста клеток.
7. Бассейн клетки из всех колб и проход 1: 5 в трех новых Т75 колбы и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО _2. После того, как клетки вновь достигнет 70%, повторите шаг 4,6 и бассейн и прохождения все прилипшие клетки во второй раз. Re-пластины все ячейки к четырем T75 колбах и инкубировать 37 ° C и 5% CO _2. Среды для выращивания стромальных клеток костного следует использовать для всех ступеней.
8. Разрешить клетки достичь слияния, мыть клетки три раза PBS и добавьте кости стромы сбора клеток СМИ (DMEM: F12 СМИ + 1x сосредоточены митоген суpplement + пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл); 10 мл / T75), убедившись, что этот носитель свободен от FBS. Сбор костного мозга кондиционированная среда 72 ч позже, фильтруют через фильтр 0,22 мкм, бассейн, аликвоты и хранят при -80 ° С до использования.
9. При желании подтвердить фенотип изолированных клеток стромы костного мозга (BMSC) с использованием антител против мышиного ССС-1, CD105, CD29, CD73 и CD44, с использованием стандартных методов проточной цитометрии , как описано ранее ^13.

5. Формирование лимфоузла-кондиционированной среды

1. В стерильной капот культуры ткани, инвертировать PBS пробирки, содержащей лимфатические узлы три раза, чтобы удалить остатки крови из лимфатических узлов и аспирата кровавый PBS. Повторите со свежим холодным PBS, пока раствор не становится ясно, без признаков крови.
2. Поместите лимфатические узлы в 60 мм ² стеклянных чашках Петри. С помощью двух стерильным скальпелем лезвий, фарша лимфатических узлов, неоднократно не нарезая взад и вперед, пока Tissuе фрагменты приблизительно на 1 мм ³ в размере.
3. В конической трубе, фрагменты ресуспендируют ткани в 10 мл Roswell Park Memorial института 1640 (RPMI 1640) , дополненной пенициллином (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл), 5 х 10 ^-5 М стерильного -меркаптоэтанол ( 1,75 мкл / 500 мл среды) и 10% FBS.
4. Центрифуга при 900 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют все клетки в 30 мл среды. Добавьте 5 мл среды / лунку в 6-луночные планшеты и инкубировали в течение 7 дней при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
5. После 7 дней инкубации, выбросьте носители, мыть прилипшие клетки с 5 мл теплой PBS и добавляют 5 мл свежей средой в каждую лунку. Разрешить клеткам расти до слияния (примерно 5 - 7 дней), Trypsinize, объединить все ячейки, и канал, как описано в шаге 4.6. Re-пластины ячейки на 6-луночный планшет. Повторите этот шаг три раза.
6. После трех проходов, позволяют клеткам расти до слияния, мыть лунки три раза PBS и добавьте 2 мл / лунку DMEM: F12 + 1xконцентрированная добавка митоген и пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл), гарантируя, что этот носитель свободен от FBS. Сбор лимфатических узлов с кондиционером СМИ после того, как 72 часа, бассейн, аликвоты и хранить при температуре -80 ° С до использования.
7. При желании подтвердить фенотип изолированных клеток лимфатических узлов стромальных (LNSC) с использованием антител против CD45 мыши и gp38, с использованием стандартных методов проточной цитометрии , как описано ранее ^13.

6. Использование Organ-кондиционированной среды ниже по течению Assays связанных с метастатическое поведение раковых клеток

1. После того, как орган-кондиционированной среды было сформировано как описано в пунктах 1 - 5, использовать его для выполнения различных вниз по течению клетки и анализы молекулярной биологии с целью определения влияния растворимых органов, полученных факторов на метастатической поведение раковых клеток. Примеры стандартных анализов (описанных в другом месте в литературе) , включают белковые массивы ^13, клеточные Анализы роста ^{13, клеточной миграции анализах 13, tumorsphere образование 14 и RT-PCR 15. Исходные базовые средства массовой информации используются для создания Органосохраняющие кондиционированная среда (то есть, безусловная DMEM:. F12 , дополненной 1х концентрированный митоген добавку и пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл) следует использовать в качестве отрицательного контроля ,}

Результаты

Поколение органной кондиционером СМИ

Обзор схема / схема процесса выделения органов и генерации кондиционированной среды представлен на рисунке 1, с представительными фотоизображений процедуры , показанной на ...

Обсуждение

Метастазы представляет собой сложный процесс, в котором ряд клеточных событий , в конечном счете ответственны за вторжение ткани и отдаленным опухоли учреждения ^4,30,31. Модель системы ех естественных условиях , представленные здесь могут быть использованы для изучения два ва?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate