Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten

Zusammenfassung

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Zusammenfassung

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Einleitung

Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Frauen und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle ^1. Brustkrebs hohe Mortalitätsrate ist vor allem auf das Scheitern der konventionellen Therapie zu lindern und Metastasen zu beseitigen; etwa 90% der durch Krebs verursachten Todesfälle sind auf Metastasen ^2. die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der metastatischen Kaskade zu verstehen, ist sowohl von größter Bedeutung für die Entwicklung von Therapeutika in wirksamen frühen und späten Stadium von Brustkrebs.

Frühere Forschung hat die vielstufige Natur der Metastasierung von Brustkrebs geholfen aufzuklären und es wird vermutet , dass das Ergebnis sowohl der Tumorprogression und Metastasierung auf Wechselwirkungen zwischen Krebszellen weitgehend abhängig ist und der Host - Umgebung ^3. Klinische Beobachtungen zeigen , dass viele Krebsarten Organtropismus anzuzeigen, dh., Die Neigung vorzugsweise an spezifischen metastasieren organs.In der case von Brustkrebs breitet sich ein Patient die Krankheit in der Regel oder metastasiert bis 5 wichtigsten Sehenswürdigkeiten, wie der Knochen, Lunge, Lymphknoten, Leber und Gehirn ^4-6. Viele Theorien wurden entwickelt, um diesen Prozess zu erklären, aber nur wenige haben den Test der Zeit überstanden. Ewing Theorie der Metastasierung, in den 1920er Jahren vorgeschlagen, die Hypothese aufgestellt dassdie Verteilung der Metastasierung auf mechanische Faktoren streng zurückzuführen war; wodurch Tumorzellen im ganzen Körper durch normale definierten physiologischen Blutflussmuster und einfach verhaften in der ersten kapillaren Bett getragen werden , stoßen sie auf ^7. Im Gegensatz dazu 1889 Stephen Paget "Saatgut und Boden", schlug Hypothese, dass zusätzliche molekulare Wechselwirkungen für das Überleben und das Wachstum von Metastasen verantwortlich waren, wobei Krebszellen ( "Samen") sich nur etablieren können und proliferatein Organ Mikroumgebungen, die entsprechenden molekularen Faktoren ( "Boden erzeugen ⁸ "). Fast ein Jahrhundert später, Leonard Weiss unternahm eine Meta-Analyse von zuvor Autopsie Daten veröffentlicht und bestätigt Ewing-Vorhersage, dass viele Metastasen zum Zeitpunkt der Autopsie festgestellt wurden in den zu erwartenden Verhältnissen gefunden, dass, wenn metastasierendem Organtropismus wurde durch Blutflussmuster allein bestimmt zu erwarten wäre. Doch in manyinstances gab es weniger oder mehr Metastasen an bestimmten Stellen gebildet , dann würde durch Ewing vorgeschlagene mechanische Faktoren ⁹ zu erwarten. Diese Konten und Theorien besagen, dass bestimmte Organ Mikroumgebungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung Muster und das anschließende Wachstum und das Überleben von vielen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs.

Frühere Forschungsanstrengungen haben sich hauptsächlich auf Tumorzellen abgeleitet Faktoren konzentriert und ihren Beitrag zur Organtropismus bei Brustkrebs Metastasen beobachtet ^10-12, jedoch wenig Forschung erforscht Faktoren aus dem Organ Mikro abgeleitet , die eine günstige Nische für die Einrichtung zur Verfügung stellen kannvon Brustkrebs Metastasen. Dies ist im Wesentlichen auf die technischen Herausforderungen der Komponenten des Organs Mikroumgebung in vitro zu studieren.

Der aktuelle Artikel beschreibt ein umfassendes ex vivo Modellsystem zur Untersuchung des Einflusses von löslichen Bestandteilen des Lymphknotens studieren, Knochen, Lunge und Gehirn auf dem metastatischen Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen. Frühere Studien haben dieses Modellsystem validiert durch den Nachweis , dass verschiedene Brustkrebszelllinien Zelllinie spezifische und organspezifische bösartige Verhalten als Reaktion auf organ konditionierten Medien angezeigt werden , die auf ihre in vivo Metastasepotential ¹³ entspricht. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um lösliche Faktoren zu identifizieren und zu bewerten spezifischen organ abgeleitet, die eine Rolle bei der metastatischen Verhaltens von Brustkrebs und anderen Arten von Krebszellen, einschließlich Einflüsse auf das Wachstum, der Migration spielen kann, stielartigen Verhalten und Genexpression, sowie die Identifizierung vonmögliche neue therapeutische Ziele für Krebs. Dies ist das erste ex vivo Modellsystem , das verwendet werden kann , organspezifische metastatischen Verhalten im Detail zu untersuchen und die Rolle der organ abgeleiteten löslichen Faktoren in den Antrieb der Prozess der Krebsmetastasen zu bewerten.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care durchgeführt, unter Protokolle, die von der Western University Tiergebrauch Subcommittee genehmigt.

1. Organ Isolation (Lunge, Gehirn, Knochen, Lymphknoten)

1. Bereiten vier sterile 50 ml konische Röhrchen (eine für jedes Organ isoliert werden), die etwa 30 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Pre-wiegen jedes Röhrchen PBS eine elektronische Waage.
2. Euthanize 6-12 Wochen alten Maus durch CO ₂ Inhalation. 2 min , oder bis die Maus nicht mehr bewegt und die Atmung - Mäuse sollte etwa 1 in der CO ₂ Kammer gelassen werden. Erfolgreiche Euthanasie kann durch einen Mangel an Herzschlag bestätigt werden, wenn von Hand mit einem Finger überprüft. Vermeiden Sie Zervikaldislokation da diese Methode der Blutgefäße des Halses führt zu Schwierigkeiten entfernen axillären Lymphknoten können bersten.
   Hinweis: Frühere Arbeiten haben speziell verwendetgesunde weibliche Nacktmäuse HSD: Athymischen NUDE Foxn1 ^{nu 13.}
3. In einer sterilen Kultur Haube Gewebe, legen Sie die Maus auf dem Rücken auf einer Polystyrol-Schaumpolster, verteilt die Glieder und verwenden Stifte sie an ihrem Platz zu halten.
4. Mit einer sterilen Pinzette und Schere, schneiden Sie die Bauchhaut an der Mittellinie an den Genitalien und nach oben in Richtung auf den Mund geschnitten. Ziehen Sie die Bauchhaut aus den Bauchmuskeln zurück und an Ort und Stelle auf dem Polystyrolschaumstoffpolster Pin.
5. Suchen Sie den axillären, brachial und Leistenlymphknoten.
   Anmerkung: Die Lymphknoten werden normalerweise von Fettgewebe umgeben ist. Die Leistenlymphknoten sind am einfachsten zu finden, wie sie oberflächlich an der Kreuzung von zwei Blutgefäße auf der nach hinten gezogen Bauchhaut zu finden sind. Axillary und brachial Lymphknoten befinden sich tiefer in das Gewebe und erfordern sanfte Rangieren von Gewebe.
   1. Nachdem Sie die Lymphknoten gefunden haben, verwenden Sie die Schere sanft und vorsichtig die Lymphe schneiden nichtdes von der Haut, Fett und Behälter und aus der Maus zu entfernen. Um zu bestätigen, richtige Präparation, rollen die Zange über das entfernte Gewebe. Wenn ein harter Klumpen besteht, wenn die Zange über das Gewebe rollt, dann hat ein Lymphknoten wahrscheinlich erfolgreich entfernt wurde.
   2. Legen entfernt Lymphknoten in eiskaltem PBS.
6. Mit Hilfe der Pinzette und Schere, öffnen Sie die Bauchhöhle durch in einer Aufwärtsbewegung in Richtung der Brust durch die freiliegenden Bauchwand zu schneiden. Vorsichtig durch das Brustbein geschnitten, die Brusthöhle ausgesetzt wird.
7. Suchen Sie die Blende unterhalb der Lunge und die Membran geschnitten. Es sollte sich an den Rippen aufgrund der Spannung ziehen.
8. Heben Sie die Lungen von unten und schneiden Sie das darunter liegende Gewebe in Richtung der Luftröhre. Dies ermöglicht die Lunge frei aus der Brusthöhle entfernt werden. Entfernen Sie das Herz und die Lunge en bloc und in eiskaltem PBS. Das Herz kann aus den Lungen hier oder nur entfernt werden, bevor in Schritt 2 wiegen.
9. Entferne dasStifte, auf dem Polystyrolschaumstoffpolster mit der Maus an Ort und Stelle zu halten. Drehen Sie die Maus über und schneiden Sie die Haut des unteren Rückens den ganzen Weg über von Flanke zu flankieren.
10. ein steriles Stück Gaze Mit dem Torso der Maus, ziehen Sie die Rückenhaut der Maus über die Beine und Füße der Maus zu halten.
11. Mit dem gleichen Stück steriler Gaze, halten Sie die Unterschenkel an Ort und Stelle, sorgfältig das Sprunggelenk des Maus-Fuß brechen und schälen die Haut über dem Gelenk proximal zu dem Kniegelenk.
12. Mit einer Schere, entfernen Sie die Tibia frei aus dem Kniegelenk und in eiskaltem PBS.
13. Wiederholen Sie die Schritte 1.11) bis 1,12) mit entgegengesetzten Glied.
14. Mit einer Pinzette, halten Sie die Oberschenkel an Ort und Stelle, wegschneiden die Schere umgebenden Muskelgewebe verwenden und den Oberschenkelknochen zu entfernen, es in eiskaltem PBS platzieren.
15. Wiederholen Sie Schritt 1.14) mit entgegengesetzten Extremität.
16. Mit einem neuen Stück steriler Gaze, halten Sie den Kopf der Maus an Ort und Stelle. Mit einer Pinzette und Schere, entfernen Sie die Haut sanft die s aussetzenKull. Mit einer Schere schneiden Sie vorsichtig die Hinterhaupts Schädel von oben in der Mitte in einer geraden und nach unten Linie die hintere Gehirn aufzudecken.
17. Mit einer Pinzette, eine Schaufel unter dem Gehirn in Richtung der vorderen und entfernen Sie das gesamte Gehirn. Legen Sie das Gehirn in eiskaltem PBS.
18. Wiederholen der Schritte 1.1) bis 1,17) für mindestens vier Mäusen.

2. Organ Wiegen

1. Nach Organ Isolation, wiegen jedes PBS Rohr Lungen- und Hirngewebe enthält eine elektronische Waage.
2. Berechnen Sie die Gewichtsdifferenz durch die Pre-Isolierung Gewicht subtrahiert (PBS nur) aus dem Gewicht des PBS Rohr + Organe (Lunge und Gehirn).
3. Bestimmung der Menge an Medien benötigt Gewebefragmenten aus dem berechneten Gewichtsunterschied zu resuspendieren.
   Hinweis: Lungen- und Hirngewebe sind Gewicht normalisiert durch Aufwirbelung in einem 4: 1 Medien: Gewebe-Verhältnis (vol / wt).

3. Erzeugung von Lungen- und Brain- Anlage Medien

1. In einem sterilen tAusgabe Kultur Kapuze, invertieren Röhrchen PBS, die Lunge oder Gehirn dreimal aus Organen und absaugen PBS Blut enthält Restblut zu entfernen. Wiederholen Sie mit frischem, kaltem PBS, bis eine Lösung ohne Anzeichen von Blut klar erscheint.
2. Platzieren Sie Lungen und Gehirn in getrennten 60 mm ² Petrischalen aus Glas. Mit Hilfe von zwei sterile Skalpellklingen, zerkleinern Lunge oder Gehirn durch hin und her immer wieder schneiden , bis die Gewebefragmente etwa ~ 1 mm ³ groß sind.
3. F12-Medien mit 1x konzentriert mitogen Ergänzung und Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) ergänzt: Resuspendieren Gewebefragmente in geeigneten Volumen an Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (zuvor im Schritt 2.3 bestimmt).
4. In resuspendierten Lunge oder Gehirn Gewebefragmente zu einer Vertiefung einer 6-Well-Platte.
5. Gewebefragmente in Medien Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2. Nach der Inkubation collect konditionierten Medien für jedes Gewebe und feitere verdünnt durch Zugabe von drei äquivalenten Volumina von frischem Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen.
6. Zentrifuge bei 1.000 xg in verdünnten konditionierten Medien für jedes Organ bei 4 ° C für 15 min große Gewebetrümmer zu entfernen. Sammeln Medienüberstand und filtriert durch einen 0,22 & mgr; m Spritzenfilter.
7. Pool konditionierten Medien von jedem Organ (dh., Der Lunge mit Lunge und Gehirn mit Gehirn) von mehreren Mäusen zu berücksichtigen Maus-zu-Maus - Variabilität. Aliquotieren und Speichern von Medien bei -80 ° C bis zur Verwendung konditioniert.

4. Erzeugung von Knochenmark-konditionierten Medien

1. In einer sterilen Kultur Kapuze Gewebe, schneiden überschüssige Gewebe aus dem Knochen und entfernen Epiphyse (Endstücke) aus den Knochen mit einer Schere.
2. Mit einem 27 ½ G-Nadel, bündig Markhöhle der Knochen durch Drücken 1 ml PBS durch das Zentrum eines jeden Knochen. Dies ermöglicht es Ihnen Stromazellen des Knochenmarks (BMSC) in ein frisches Röhrchen mit PBS zu sammeln.
3. Zentrifuge bei 1,000 × g für 5 min bei 4 ° C und waschen BMSC zweimal mit PBS. Resuspendieren Stromazellen des Knochenmarks in 20 ml Knochen Stroma-Zellwachstumsmedium (DMEM: F12-Medium mit 1x ergänzt konzentriert mitogen zu ergänzen, Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) und 10% fötalem Boven Serum (FBS) ).
4. Platte 10 ml resuspendiert Stromazellen des Knochenmarks in einem T75-Kolben.
   Hinweis: Kombinieren und Plattenzellen aus jeweils 2 Mäusen in jeder T75-Flasche; für vier Mäusen werden zwei T75 - Flaschen benötigt wird (etwa 1 x 10 ⁷ Zellen / Kolben).
5. Inkubieren für 24 Zellwachstumsmedien bone stromal h bei 37 ° C und 5% CO ₂ Stromazellen des Knochenmarks in. Nach der Inkubation entfernen Medien aus beiden T75-Flaschen und in neue T75-Flasche, beschriften Sie diese Flasche als "Floater Flask". In frischen Knochen Stromazellen Wachstumsmedien zur vorherigen 2 - Kolben und Inkubation alle 3 - Kolben bei 37 ° C und 5% CO _2.
6. Nachdem die Zellen erreichen etwa 70% Konfluenz (ca. 5 bis 7Tage) Passage Zellen. Um dies zu tun, entfernen Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (3 ml jeder Wäsche). Entfernen PBS und 3 ml Trypsin / EDTA-Lösung, dass Trypsin zu gewährleisten, die gesamte Oberfläche des Kolbens abdeckt. Nachdem die Zellen die Kolben abheben (~ 2 - 3 min), stoppen Trypsinierung Reaktion durch Zugabe von 3 ml Knochen Stromazellen Wachstumsmedien). Zentrifuge 900 xg für 5 min bei 4 ° C, verwerfen Medien und resuspendieren Zellen in 10 ml frischem Zellwachstum Medien Knochen Stroma.
7. Pool - Zellen aus allen Flaschen und Passage 1: 5 in drei neue T75 - Kolben und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO _2. Nachdem die Zellen wieder einmal 70% erreichen, wiederholen Sie die Schritte 4.6 und Pool und Passage alle anhaftenden Zellen ein zweites Mal. Re-Platte alle Zellen zu vier T75 - Kolben und Inkubation 37 ° C und 5% CO _2. Knochen Stroma-Zellwachstumsmedien sollten für alle Schritte verwendet werden.
8. Lassen Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fügen Knochen Stromazellen Sammlung Medien (DMEM: F12-Medium + 1x konzentriert Mitogen supplement + Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml); 10 ml / T75) und sicherstellen, dass diese Medien frei von FBS ist. Sammeln Knochenmark-konditionierten Medien 72 Stunden später, filtriert durch ein 0,22-um-Filter, Pool, aliquoten und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
9. Falls gewünscht, bestätigen Antikörper gegen Maus - Sca-1, CD105, CD29 und CD73, CD44, unter Verwendung von Standardtechniken Durchflusszytometrie den Phänotyp der isolierten Stromazellen des Knochenmarks (BMSC) unter Verwendung von ¹³ , wie zuvor beschrieben.

5. Generation von Lymph Node-konditionierten Medien

1. zu entfernen Restblut aus Lymphknoten und absaugen blutigen PBS in einer sterilen Kultur Haube Gewebe, invertieren PBS Rohr Lymphknoten dreimal enthält. Wiederholen Sie mit frischem, kaltem PBS, bis eine Lösung ohne Anzeichen von Blut klar erscheint.
2. Legen Lymphknoten in 60 mm ² Petrischalen aus Glas. Mit Hilfe von zwei sterile Skalpellklingen, zerkleinern Lymphknoten wiederholt hin und her, bis das Schneiden tissue Fragmente sind etwa 1 mm ³ in der Größe.
3. In einem konischen Rohr, resuspendieren Gewebefragmente in 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) Medium mit Penicillin (50 & mgr; g / ml) supplementiert / Streptomycin (50 ug / ml), 5 x 10 ^-5 M β-Mercaptoethanol sterile ( 1,75 & mgr; l / 500 ml Medium) und 10% FBS.
4. Zentrifuge bei 900 × g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung alle Zellen in 30 ml Medium. 5 ml Medium / Vertiefung in einer 6-Well - Platte und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Nach der 7-tägigen Inkubation verwerfen Medien, waschen anhaftenden Zellen mit 5 ml warmem PBS und 5 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung. Lassen Zellen bis zur Konfluenz wachsen (ca. 5-7 Tage), trypsinize, bündeln alle Zellen, und der Durchgang, wie in Schritt 4.6 beschrieben. Re-Platte Zellen bis 6-Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
6. Nach drei Passagen erlauben Zellen bis zur Konfluenz, waschen Vertiefungen dreimal mit PBS und 2 ml / Vertiefung DMEM wachsen: F12 + 1xkonzentrierte mitogen Ergänzung und Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml), um sicherzustellen, dass dieses Medium frei von FBS ist. Sammeln Lymphknoten-konditionierten Medien nach 72 h, Pool, aliquoten und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
7. Falls gewünscht, kann bestätigen , Antikörper gegen Maus CD45 und gp38, unter Verwendung von Standard - Durchflusszytometrie Techniken , um den Phänotyp der isolierten Lymphknoten Stromazellen (LNSC) unter Verwendung von wie zuvor ¹³ beschrieben.

6. Verwendung von Organ-konditionierten Medien für Downstream-Assays mit Bezug zu Metastasiertem Verhalten von Krebszellen

1. Sobald die organ konditionierten Medien wurde wie beschrieben erzeugt in den Schritten 1 bis 5, verwenden sie verschiedene Downstream Zell- und Molekularbiologie Assays durchzuführen, um den Einfluss der löslichen organ abgeleiteten Faktoren auf das metastatische Verhalten von Krebszellen zu bestimmen. Beispiele von Standardassays ( an anderer Stelle in der Literatur beschrieben) umfassen Protein - Arrays ^13, das Zellwachstum Assays ^{13, Zellmigration Assays 13, tumorsphere Bildung 14 und RT-PCR 15. Die ursprüngliche Basismedium verwendet , um die organ konditionierte Medien zu erzeugen (dh unconditioned DMEM. F12 Medium mit 1x Ergänzung konzentriert Mitogen ergänzt und Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) als Negativkontrolle verwendet werden , .}

Ergebnisse

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien

Ein Übersichtsdiagramm / schematische Darstellung des Prozesses der organ Isolierung und Erzeugung von konditionierten Medien ist in Abbildung 1, mit repräsentativen photographischen Bildern des Verfahrens in Figur 2 gezeigt dargestellt. Es ist zu beachten , dass , wenn dieses Protokoll zunächst in der Entwicklung war, Leber aufgenommen ...

Diskussion

Metastasierung ist ein komplexer Prozess , bei dem eine Reihe von zellulären Ereignissen letztlich für Gewebe verantwortlich sind , Invasion und entfernten Tumor Einrichtung ^4,30,31. Die ex vivo Modellsystem hier präsentiert werden können genutzt zu studieren zwei wichtige Aspekte des metastasierten Progression: Krebszelle Homing oder Migration auf ein bestimmtes Organ ( "getting there") und das Wachstum in diesem Organ ( "dort wachsen"). Viele Studien haben sich auf die Ermit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate