乳がん転移挙動に関する器官特異的影響を研究するためのオルガン付きメディアおよびアプリケーションの生成

要約

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

要約

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

概要

乳がんは女性で最も頻繁に診断される癌および癌関連死¹の第二の主要な原因です。乳がんの死亡率の高さは、主に転移性疾患を軽減し、排除する従来の治療の失敗によるものです。癌関連死の約90％は、転移²によるものです。転移カスケードの根底にある分子機構を理解することは、初期および後期段階の乳癌の両方で効果的な治療法の開発に最も重要です。

過去の研究では、乳癌転移の多段階の性質の解明に役立っており、癌の進行および転移の両方の結果は、癌細胞と宿主環境³との間の相互作用に大きく依存すると仮定されます。臨床観察は、多くの癌、 すなわち 、臓器向性を表示することを示している。、傾向が優先CAS organs.In特定に転移します乳癌のEは、患者の疾患は、典型的には、広がるか、骨、肺、リンパ節、肝臓、および脳^4-6を含む5つの主要な部位に転移します。多くの理論は、このプロセスを説明するために開発されてきたが、わずか数は、時の試練に耐えてきました。転移のユーイング理論は、1920年代に提案され、転移のthatthe分布が厳密に機械的要因によるものであった仮定しました。腫瘍細胞は正常な定義された生理の血流パターンによって身体全体に運ばれ、単に最初の毛細血管床に逮捕されたことにより、彼らは^7に遭遇^します 。これとは対照的に、スティーブン・パジェット1889「種と土壌」仮説は、癌細胞（「シード」）は自分自身だけと適切な分子の要因（「土を生成proliferatein臓器微小環境を確立することができる、追加の分子相互作用は、転移の生存と成長のための責任があったことを示唆しました^"）8。ほぼ一世紀後に、レナード・ワイスの下で以前に発表された剖検データのメタ分析を取り、剖検時に検出多くの転移性腫瘍が転移臓器向性は、単独での血流パターンによって決定した場合に予想される予想される割合で発見されたことをユーイング予測を確認しました。しかし、manyinstancesでその後ユーイング提案機械的要因⁹によって予想される特定の部位に形成され、より少ないまたはそれ以上の転移がありました。これらのアカウントと理論は、特定の臓器微小環境が普及パターンと乳癌を含む多くの癌のその後の成長と生存に重要な役割を果たしていることを示唆しています。

過去の研究努力は、主に腫瘍細胞由来因子に着目し、乳癌転移^10-12で観察された臓器向性への貢献、しかし少し研究は、設立のための有利なニッチを提供することができる臓器微小環境由来の要因を検討していています乳癌転移の。これは、in vitroでの臓器微小環境の成分を研究する技術的課題に負うところが大きいです。

現在の記事は、ヒト乳癌細胞の転移挙動のリンパ節、骨、肺、および脳の可溶性成分の影響を研究するための包括的なのex vivoモデルシステムが記載されています。以前の研究は、異なる乳癌細胞株は、それらのin vivoでの転移能¹³に対応する器官馴化培地に応答して、細胞株特異的および器官特異的悪性の挙動を示すことを実証することによって、このモデル系を検証しています。このモデル系は、増殖、遊走、幹様挙動、および遺伝子発現に影響を​​含む乳癌癌細胞の他のタイプの転移挙動において役割を果たし得る特定の器官由来の可溶性因子を同定および評価するために使用することができ、同様の識別癌のための潜在的な新規治療標的。これは、具体的に器官特異的転移挙動を研究するために、および癌転移の過程を駆動する器官由来の可溶性因子の役割を評価するために使用することができる第一のex vivoモデル系です。

プロトコル

すべての動物実験は、ウェスタン大学の動物利用小委員会によって承認されたプロトコルの下で、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従って行いました。

1.臓器の単離（肺、脳、骨、リンパ節）

1. 4滅菌50ミリリットルにコニカルチューブを準備し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の約30ミリリットルを含む（各臓器のための1を分離することにします）。電子天秤を用いて、PBSの各チューブを事前に重量を量ります。
2. CO ₂吸入によって6-12週齢のマウスを安楽死させます。 2分またはマウスが移動し、呼吸停止するまで-マウスは、約1のためにCO ₂チャンバー内に残されるべきです。指を使って手動でチェックすると成功した安楽死は、さらにハートビートの欠如によって確認することができます。この方法として、頸椎脱臼を回避する腋窩リンパ節を除去することが困難につながる首の血管を破裂することができます。
   注：以前の研究は、具体的に使用しています健康な女性のヌードマウス、HSD：無胸腺Nude- Foxn1 ^nuの ^13。
3. 滅菌組織培養フードでは、ポリスチレンフォームパッドの上に仰向けにマウスを置いて手足を広げて、場所でそれらを保つためにピンを使用します。
4. 滅菌ピンセットやハサミを使用して、生殖器で正中線で腹部の皮膚を切ると口に向かって上向きにカット。ゆっくりポリスチレンフォームパッドの上に所定の位置に腹筋とピンから腹部の皮膚を引き戻します。
5. 腋窩、上腕および鼠径リンパ節の位置を確認します。
   注：リンパ節は、通常、脂肪組織に囲まれています。鼠径リンパ節は、それらが引き戻さ腹部皮膚上の2つの血管の接合部に表面的に見られるように配置することが最も簡単です。腋窩及び上腕リンパ節を組織内に深く位置し、組織の穏やかな操縦を必要としています。
   1. あなたはリンパ節を見つけた後、静かに、慎重に何のリンパ節をカットするはさみを使用しませんデ肌、脂肪や血管から、マウスから削除します。適切な解剖を確認するには、削除された組織の上に鉗子をロールバックします。組織の上に鉗子を転がすときに硬いしこりが存在する場合は、リンパ節は、おそらく正常に削除されました。
   2. 氷冷PBSで削除リンパ節を置きます。
6. ピンセットやハサミを使用して、胸に向かって上昇運動にさらさ腹壁を切開により腹腔を開きます。慎重に胸腔を露出し、胸骨を切断。
7. 肺下の横隔膜の位置を確認し、振動板をカット。それは緊張に起因するリブに向かって引っ張る必要があります。
8. 下から肺を持ち上げて、気管に向かって下にある組織をカット。これは、肺が胸腔から自由に削除することができます。氷冷PBSでブロックし、場所エン心臓や肺を削除します。心臓は、ステップ2に計量前に必ずこちらか、単に肺から除去することができます。
9. 削除しますピン、ポリスチレンフォームパッド上の所定の位置でマウスを保ちます。マウスを裏返しと隣接するすべての方法サイドから全体の腰の皮膚をカット。
10. マウスの胴体を保持するために、ガーゼの滅菌片を用いて、マウスの足と足の上にマウスの背中の皮膚の皮をむきます。
11. 滅菌ガーゼの同じ部分を使用して、慎重に、所定の位置に下肢を保持するマウスの足の足首関節を破壊し、膝関節に向かって近位関節上の皮膚の皮をむきます。
12. はさみを使用して、氷冷PBSで膝関節と場所から自由に脛骨を削除します。
13. 繰り返して、反対側の手足に）1.12）1.11を繰り返します。
14. 鉗子を使用して、氷冷PBSに置く、はさみを使用して、周囲の筋肉組織を切り取ると大腿骨を除去し、所定の位置に大腿骨を保持します。
15. 反対側の手足と手順を繰り返し1.14）。
16. 滅菌ガーゼの新しい作品を使用して、所定の位置にマウスの頭部を保持します。ピンセットやハサミを使用して、そっと秒を公開するために皮膚を除去カル。はさみを使用して、慎重に後部脳を露出するようにまっすぐ下方ラインの上部中央から後頭部頭蓋骨をカット。
17. 鉗子を使用して、前方に向かって脳の下にスクープと脳全体を削除します。氷冷PBSで脳を置きます。
18. 少なくとも4匹のマウスのためのステップ1.1）1.17へ）を繰り返します。

2.オルガン計量

1. 臓器単離後、電子天秤を用いて、肺および脳組織を含む各PBSチューブの重量を量ります。
2. PBS管の重量+臓器（肺及び脳）からプレ分離重量（PBSのみ）を差し引くことにより、重量差を計算します。
3. 計算された重量差から組織片を再懸濁するために必要なメディアの量を決定します。
   注：1メディア：組織比（容量/重量）肺および脳組織を4に再懸濁することによって正規化量です。

Lung-と脳 - 馴化培地の3世代

1. 無菌トンで問題培養フード、血液を含む臓器や吸引PBSから残留血液を除去するために、肺や脳の3回を含むPBSチューブを反転。解決策は、血液の証拠と透明になるまで新鮮な冷PBSで繰り返します。
2. 独立した60ミリメートル²ガラスペトリ皿に肺や脳を置きます。 2滅菌メスの刃を使用して、組織フラグメントのサイズが〜1ミリメートル約³になるまで繰り返し前後にスライスして、肺や脳をミンチ。
3. 再懸濁組織断片は、適切な音量にダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の（ステップ2.3で事前に決定）：1×を補充したF12培地は、マイトジェンサプリメントとペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ ml）を濃縮しました。
4. 6ウェルプレートの1ウェルに再懸濁させ、肺や脳組織断片を追加します。
5. 37℃で24時間、5％CO ₂のメディアに組織片をインキュベートします。インキュベーション後、各組織およびfのための馴化培地を収集urther 50ミリリットルコニカルチューブに新鮮な培地の3同等のボリュームを追加することによって希釈します。
6. 大規模な組織片を除去するために15分間、4℃で各器官のための希釈された馴化培地1,000×gで遠心分離します。メディア上清を収集し、0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。
7. プールは、各臓器からの馴化培地（ すなわち 、脳と肺や脳と肺）は、複数のマウスからのマウス・ツー・マウスの変動を考慮するために。アリコートとストアが使用するまで-80℃で馴化培地。

骨髄馴化培地の4世代

1. 滅菌組織培養フードでは、骨から過剰な組織をトリミングして、ハサミで骨から骨端（エンドピース）を取り外します。
2. 各ボーンの中心を通って1mlのPBSを押すことによって、骨の27½G針、フラッシュ髄腔を使用しました。これは、PBSを含有する新鮮なチューブに骨髄間質細胞（BMSC）を収集することができます。
3. 1,00での遠心分離0は、4℃で5分間XGおよびPBSで2回BMSCを洗います。骨間質細胞増殖培地20ml中に再懸濁した骨髄間質細胞（DMEMは：1×を補充したF12培地は、マイトジェンサプリメント、ペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ ml）および10％胎児バルボーベン血清（FBS）を濃縮しました）。
4. プレート1 T75フラスコ中で再懸濁した骨髄間質細胞を10ml。
   注：各T75フラスコ内の各2匹のマウスから合わせて、プレートの細胞; 4匹のマウスのために、2 T75フラスコを（約1×10 ⁷細胞/フラスコ）必要とされています。
5. 37℃で24時間、5％CO ₂のための骨間質細胞の増殖培地に骨髄間質細胞をインキュベートします。インキュベーション後、両方のT75フラスコからメディアを削除し、新しいT75フラスコに入れ、「フローターフラスコ」として、このフラスコにラベルを付けます。前の2フラスコに新鮮な骨間質細胞増殖培地を追加し、全37℃で3フラスコおよび5％CO _2をインキュベートします。
6. 7 - 細胞は、約70％の集密度（約5に到達した後日）継代細胞。これを行うには、培地を除去し、PBS（3ミリリットル各洗浄）で2回細胞を洗浄します。 PBSを削除し、トリプシン/ EDTA溶液の3ミリリットルを追加し、そのトリプシンをフラスコの表面全体を覆​​っている確保します。細胞がオフフラスコ持ち上げた後（約2 - 3分間）3mlの骨間質細胞の増殖培地を添加することによりトリプシン処理反応を停止させます）。遠心分離機は、900×gで4℃で5分間、新鮮な骨間質細胞増殖培地10mlにメディア、再懸濁細胞を廃棄します。
7. すべてのフラスコおよび継代1からプール細胞：5つの新しいT75フラスコに、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。細胞は再び70％に到達した後、ステップ4.6およびプールとの通路すべての付着細胞をもう一度繰り返します。再プレートすべての4つのT75フラスコに細胞とは、37℃、5％CO _2をインキュベートします。骨間質細胞の増殖培地は、全ての工程のために使用されるべきです。
8. 細胞は、骨間質細胞収集メディアを、コンフルエンスに達するPBSで細胞を3回洗浄し、追加することができます（DMEM：F12培地+ 1倍に濃縮マイトジェンのsupplement +ペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）;このメディアは、FBSの自由であることを確認して10ミリリットル/ T75）、。 72時間後に骨髄馴化培地を収集し、使用するまで-80℃で0.22μmのフィルター、プール、アリコート、およびストアを介してフィルタリングします。
9. 所望であれば、以前に¹³に記載のような標準的なフローサイトメトリー技術を用いて、マウスのSca-1、CD105、CD29、およびCD73、CD44に対する抗体を用いて単離した骨髄間質細胞（BMSC）の表現型を確認します。

リンパ節付きメディアの5世代

1. 無菌組織培養フード中で、リンパ節および吸引血のPBSから残留血液を除去するためにリンパ節を3回含むPBSチューブを反転させます。解決策は、血液の証拠と透明になるまで新鮮な冷PBSで繰り返します。
2. 60ミリメートル²ガラスシャーレ内のリンパ節を置きます。繰り返しTISSUまで前後にスライスして2滅菌メスの刃、ミンチリンパ節を使用して、E断片のサイズは約1mm ³です。
3. 円錐管では、ロズウェルパーク記念研究所1640（RPMI1640）ペニシリン（50μg/ ml）を添加した培地/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）、5×10 ^-5 Mの滅菌βメルカプトエタノールの10ml中に再懸濁組織断片（ 1.75μL/ 500mLの培地）および10％FBS。
4. 4℃で5分間、900×gで遠心分離し、30mLの培地中のすべての細胞を再懸濁。 5ミリリットルメディア/ 6ウェルプレートに加え、37℃で7日間、5％CO ₂インキュベートします。
5. 7日間のインキュベーションの後、培地を捨て、温かいPBS 5mlで接着細胞を洗浄し、各ウェルに5ミリリットルを新鮮な培地を追加します。細胞が密集するまで増殖させ（約5から7日間）、トリプシン処理、ステップ4.6で説明したように、すべてのセル、および流路をプールします。 6ウェルプレートに再プレート細胞。この手順を3回繰り返します。
6. 3継代後、PBSでウェルを3回洗浄し、追加し、細胞がコンフルエントになるまで成長することを可能にする2ミリリットル/ウェルのDMEM：F12 + 1×このメディアは、FBSの自由であることを確実に濃厚マイトジェンサプリメントとペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）、。使用するまで-80℃で72時間、プール、アリコート、およびストアの後にリンパ節馴化培地を収集します。
7. 所望であれば、以前に¹³に記載のような標準的なフローサイトメトリー技術を用いて、マウスCD45およびGP38に対する抗体を用いて単離されたリンパ節間質細胞（LNSC）の表現型を確認します。

癌細胞の転移挙動に関連するダウンストリームのアッセイのためのオルガン付きメディアの6.

1. 5、癌細胞の転移挙動の可溶性器官由来の因子の影響を決定するために、別の下流の細胞および分子生物学アッセイを実施するために使用 - 器官馴化培地たらステップ1に記載したように生成されています。 （文献の他の箇所に記載）の標準的なアッセイの例としては、タンパク質アレイ^13、細胞増殖アッセイ、 ^{13、細胞遊走アッセイ13、tumorsphere形成14、およびRT-PCR 15。元のベース媒体は、（臓器馴化培地を生成するために使用される、すなわち 、無条件DMEM：1×を補充したF12培地）をマイトジェンサプリメント及びペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの濃縮陰性対照として使用されるべきです。}

結果

オルガン付きメディアの生成

臓器の単離および馴化培地の生成のプロセスの概要図/概略図を図2に示す手順の代表的な写真画像と、 図1に示されている。このプロトコルは、最初の開発中であった場合、肝臓が含まれていたことに留意すべきです我々の分析では、乳癌転移の一般的な...

ディスカッション

転移は、携帯一連のイベントは、組織浸潤および遠隔腫瘍の確立^4,30,31のための最終的な責任であることにより、複雑なプロセスです。特定の臓器（「そこの取得」）およびその器官（「そこに成長している」）の成長に癌細胞のホーミングまたは移行：ここで紹介するのex vivoモデル系は、転移性進行の二つの重要な側面を研究するために利用することができます。多くの研究...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate