Geração de mídia e aplicativos Organ-condicionado para o Estudo Influências específicas do órgão em cancro da mama metastático Comportamento

Resumo

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Resumo

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Introdução

O câncer de mama é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em mulheres ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer ^1. alta taxa de mortalidade do câncer de mama é principalmente devido à falha da terapia convencional para reduzir e eliminar a doença metastática; aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer é atribuída a metástases ^2. A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes da cascata metastática é fundamental para o desenvolvimento de terapias eficazes, tanto precoce e cancro da mama de fase tardia.

A pesquisa passada ajudou a elucidar a natureza de várias etapas de metástase do câncer de mama e é a hipótese de que o resultado de ambos progressão e metástase do câncer é em grande parte dependente das interações entre células cancerosas e o ambiente host ^3. As observações clinicas indicam que muitos cancros mostrar tropismo de órgãos, isto é., A tendência para metastizar preferencialmente a organs.In específica do CASe de cancro da mama, doença de um paciente geralmente se espalha ou metástases para 5 locais principais, incluindo o osso, pulmões, nódulo linfático, fígado, cérebro e ^06/04. Muitas teorias têm sido desenvolvidas para explicar esse processo, mas apenas alguns têm resistido ao teste do tempo. A teoria de Ewing de metástase, proposto na década de 1920, a hipótese de thatthe de distribuição de metástase era estritamente devido a fatores mecânicos; pelo qual as células de tumor são realizadas por todo o corpo por padrões de fluxo sanguíneo fisiológico definidos normais e simplesmente prender no primeiro leito capilar encontram ^7. Em contraste, a "semente e solo" hipótese de Stephen Paget 1889 sugeriu que as interações moleculares adicionais foram responsáveis ​​pela sobrevivência e crescimento de metástases, através do qual as células cancerosas ( "sementes") só pode estabelecer-se e microambientes órgãos proliferatein que produzem factores moleculares apropriados ( "solo ") ^8. Quase um século depois, Leonard Weiss sobtomou uma meta-análise dos dados da autópsia confirmou anteriormente publicados e predição de Ewing que muitos tumores metastáticos detectados na altura da necropsia foram encontrados nas proporções esperadas, que seria de esperar se o tropismo órgão metastática foi determinada por padrões de fluxo sanguíneo sozinho. No entanto, em manyinstances havia menos ou mais metástases formadas em certos locais, então seria de esperar por um projecto de factores mecânicos de Ewing ^9. Estas contas e teorias sugerem que microambientes de órgãos específicos desempenham um papel fundamental nos padrões de divulgação e subsequente crescimento e sobrevivência de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama.

Os esforços de investigação anteriores têm focado principalmente em fatores derivados de células do tumor e sua contribuição para o tropismo órgão observado na metástase do câncer de mama ^10-12, fatores no entanto pouca pesquisa tem explorado derivados do microambiente órgão que pode fornecer um nicho favorável para o estabelecimentode metástases de cancro da mama. Esta é em grande parte atribuível aos desafios técnicos de estudar os componentes do microambiente do órgão in vitro.

O presente artigo descreve um sistema abrangente vivo ex modelo para estudar a influência dos componentes solúveis do nó de linfa, osso, pulmão, cérebro e no comportamento metastático de células de cancro da mama humano. Estudos anteriores validaram este sistema de modelo, demonstrando que as linhas celulares de cancro da mama diferentes exibir comportamento maligno específica de órgãos-específico da linha de células e em resposta a meio condicionado de órgãos que corresponde ao seu potencial metastático in vivo ^13. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar os factores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e outros tipos de células cancerosas, incluindo influências sobre o crescimento, a migração, caule-como o comportamento, e a expressão do gene, , bem como a identificação depotenciais novos alvos terapêuticos para o cancro. Este é o primeiro sistema ex vivo modelo que pode ser utilizado para estudar o comportamento metastático específico do órgão em pormenor e para avaliar o papel de factores solúveis derivados de órgãos na condução do processo de metástase do cancro.

Protocolo

Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care, no âmbito de protocolos aprovados pelo Uso de Animais Subcomissão Western University.

1. Isolamento de órgãos (pulmão, cérebro, ossos, gânglios linfáticos)

1. Prepare quatro tubos de 50 ml estéreis cónicos (um para cada órgão a ser isolado) contendo aproximadamente 30 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Pré-pesam cada tubo de PBS utilizando uma balança eletrônica.
2. Eutanásia 6-12 semana rato velho por inalação de CO _2. Os ratos devem ser deixada na câmara de CO _2, durante cerca de 1 - 2 minutos ou até que o rato para de se mover e de respiração. eutanásia bem sucedida pode ser ainda confirmada pela falta de batimentos cardíacos quando verificados manualmente com um dedo. Evite deslocamento cervical como este método pode romper vasos sanguíneos do pescoço levando a dificuldade em retirar os gânglios linfáticos axilares.
   Nota: Os trabalhos anteriores usado especificamenteratinhos nus femininos saudáveis, Hsd: atímicos Nude- Foxn1 ^{nu 13.}
3. Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, coloque o mouse sobre as suas costas em uma almofada de espuma de poliestireno, espalhar os membros e usar pinos para mantê-los no lugar.
4. Utilizando uma pinça e tesouras estéreis, cortar a pele abdominal na linha média na genitália e cortar para cima em direção à boca. Gentilmente puxar para trás a pele abdominal dos músculos abdominais e pinos no local no bloco de espuma de poliestireno.
5. Localize a axilar, braquial, e linfonodos inguinais.
   Nota: Os linfonodos são geralmente rodeado por tecido adiposo. Os nódulos linfáticos inguinais são os mais fáceis de localizar como eles são encontrados superficialmente na junção de dois vasos sanguíneos na pele abdominal puxado para trás. Axilares e linfáticos braquial nós estão localizados mais profundamente no tecido e exigem manobras suave de tecido.
   1. Depois de ter localizado os gânglios linfáticos, use a tesoura para cortar suavemente e com cuidado a linfa nãodes longe da pele, a gordura e os vasos e removê-los do rato. Para confirmar dissecção adequada, rolar a pinça sobre o tecido removido. Se um nódulo duro existe quando rolar a pinça sobre o tecido, em seguida, um nó de linfa tem provavelmente foi removido com sucesso.
   2. Coloque linfonodos removidos em PBS gelado.
6. Usando os fórceps e tesouras, abrir a cavidade abdominal, cortando através da parede abdominal exposta em um movimento ascendente em direcção ao peito. Cuidadosamente cortar o esterno, expondo a cavidade torácica.
7. Localize o diafragma abaixo dos pulmões e corte do diafragma. Ele deve puxar para as costelas devido à tensão.
8. Levante os pulmões de baixo e cortar o tecido subjacente para a traqueia. Isto permite que os pulmões para ser removida livremente a partir da cavidade torácica. Retire o coração e os pulmões em bloco e coloque em PBS gelado. O coração pode ser removido dos pulmões aqui ou apenas antes da pesagem no Passo 2.
9. Remova opinos, mantendo o mouse no lugar sobre a almofada de espuma de poliestireno. Vire o mouse e cortar a pele da parte inferior das costas todo o caminho através de flanco para flanco.
10. Usando um pedaço estéril de gaze para manter o torso do mouse, tirar a pele de trás do mouse sobre as pernas e os pés do mouse.
11. Usando o mesmo pedaço de gaze estéril, segure a perna no lugar, cuidadosamente quebrar a articulação do tornozelo do pé mouse e descascar a pele sobre a articulação proximal para a articulação do joelho.
12. Com uma tesoura, retire a tíbia livre da articulação do joelho e coloque em PBS gelado.
13. Repita os passos de 1,11) a 1,12) com o membro oposto.
14. Utilizando uma pinça, segure o fêmur no lugar, cortar o tecido circundante muscular usando a tesoura e remova o fêmur, colocando-o em PBS gelado.
15. Repita o passo 1.14) com o membro oposto.
16. Usando um novo pedaço de gaze estéril, segure a cabeça do rato no lugar. Utilizando uma pinça e tesouras, remover suavemente a pele para expor as skull. Com uma tesoura, corte cuidadosamente o crânio occipital do centro da parte superior em uma linha reta e para baixo para expor o cérebro posterior.
17. Usando fórceps, escavar por debaixo do cérebro para o anterior e remover todo o cérebro. Coloque o cérebro em PBS gelado.
18. Repita os passos 1.1) a 1,17) durante pelo menos quatro ratos.

2. Órgão Pesando

1. A seguir ao isolamento de órgãos, pesam cada tubo PBS contendo pulmão e tecido do cérebro utilizando uma balança electrónica.
2. Calcula-se a diferença de peso, subtraindo o peso pré-isolamento (apenas PBS) a partir do peso do tubo de PBS + órgãos (pulmão e cérebro).
3. Determinar a quantidade de meios necessários para ressuspender os fragmentos de tecido a partir da diferença de peso calculado.
   Nota: de pulmão e tecido cerebral são em peso normalizada, por re-suspensão em uma mistura 4: 1 de meios: proporção tecido (vol / peso).

3. Geração de Mídia Lung- e cérebro-condicionado

1. Num t estérilemissão cultura capô, inverter tubos PBS contendo pulmão ou cérebro três vezes para remover o sangue residual de órgãos e aspirado PBS contendo sangue. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue.
2. Coloque pulmões e cérebros em separado 60 milímetros ² pratos de petri de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, pulmões moer ou cérebros por várias vezes cortar e para trás até fragmentos de tecido são aproximadamente ~ 1 ^mm3 de tamanho.
3. Ressuspender fragmentos de tecido num volume apropriado (previamente determinado no passo 2.3) de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): F12 suplementado com suplemento concentrada 1x penicilina e mitogénio (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml).
4. Adicionar fragmentos pulmonares ou tecido cerebral ressuspensos para um poço de uma placa de 6 poços.
5. Incubar fragmentos de tecidos em meio, durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO _2. Após a incubação, recolher meios condicionados para cada tecido e fUTRAS diluir pela adição de três volumes equivalentes de meio fresco em um tubo de 50 ml.
6. Centrifugar a 1.000 xg em meios condicionados diluídos para cada órgão a 4 ° C durante 15 min para remover grandes restos de tecido. Recolher o sobrenadante de mídia e filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 mM.
7. Piscina meios condicionados de cada órgão (ie., Pulmão com pulmão e cérebro com cérebro) a partir de vários ratos para explicar a variabilidade do mouse-a-mouse. Alíquotas e armazenamento de meios condicionados à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.

4. geração de mídia de Medula Óssea condicionado

1. Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, aparar o excesso de tecido do osso e remover epífises (peças finais) dos ossos com uma tesoura.
2. Usando uma agulha G 27 ½, cavidade medular dos ossos descarga, empurrando 1 ml de PBS através do centro de cada osso. Isso permitirá que você para coletar células do estroma da medula óssea (BMSC) para um tubo fresco contendo PBS.
3. Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C e lava-se duas vezes com PBS BMSC. Ressuspender as células do estroma da medula óssea em 20 ml de meio de crescimento de células de estroma ósseo (DMEM: F12 suplementado com 1x concentrada mitogénio suplemento, penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) e 10% de soro Boven fetal (FBS) ).
4. Placa 10 ml de células estromais de medula óssea ressuspensas em um frasco T75.
   Nota: Combine e células da placa de cada 2 ratos em cada frasco T75; por quatro camundongos, dois frascos T75 são necessários (cerca de 1 x 10 ⁷ células / frasco).
5. Incubar as células do estroma da medula óssea em meio de crescimento de células de estroma ósseo durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO _2. Após a incubação, remover a mídia de ambos os frascos T75 e colocar em novo frasco T75, rotular este frasco como "Floater Flask". Adicionar meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo para frascos anteriores 2 e incuba-se todos os frascos de 3 a 37 ° C e 5% de CO _2.
6. Depois de células atingirem aproximadamente 70% de confluência (aproximadamente 5-7dias), as células de passagem. Para fazer isso, remover o meio e lavar as células duas vezes com PBS (3 mL cada lavagem). Remover PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina / EDTA, assegurando que a tripsina cobre toda a superfície do frasco. Depois de células retire o frasco (~ 2-3 min), pare tripsinização reacção por adição de 3 ml de osso meio de crescimento de células do estroma). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar meios de comunicação, e ressuspender as células em 10 ml de meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo.
7. Células de associação de todos os frascos e a passagem 1: 5 em três novos frascos T75 e incubar a 37 ° C e 5% de CO _2. Depois de as células mais uma vez chegar a 70%, repita o passo 4.6 e piscina e de passagem todas as células aderentes uma segunda vez. Re-placa de todas as células para frascos T75 e quatro incubar a 37 ° C e 5% de CO _2. meios de crescimento celular de estroma ósseo deve ser utilizado para todos os passos.
8. F12 + 1x mitogen concentrada su: permitir que as células para alcançar a confluência, lavar as células três vezes com PBS e adicionar estromal meios de recolha de células ósseas (DMEMpplement + penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml); 10 ml / T75), certificando-se que esta mídia é livre de FBS. Recolha de meio condicionado de medula óssea de 72 horas mais tarde, filtra-se através de um filtro de 0,22 um, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
9. Se desejado, confirmar o fenótipo das células do estroma da medula óssea (BMSC) isolados utilizando anticorpos contra a Sca-1 de rato, CD105, CD29, e CD73, CD44, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente ^13.

5. geração de mídia Linfonodo condicionado

1. Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, inverter tubo PBS contendo nódulos linfáticos três vezes para remover o sangue residual de nódulos linfáticos e aspirado sangrenta PBS. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue.
2. Coloque os gânglios linfáticos em placas de Petri de 60 ^mm2 de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, gânglios linfáticos picada por várias vezes cortar e para trás até tissue fragmentos são aproximadamente 1 mm ³ de tamanho.
3. Num tubo de cónico, fragmentos de tecido ressuspender em 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) meio suplementado com penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml), 5 x 10 ^-5 M estéril β-mercaptoetanol ( 1,75 ul / 500 ml de meio) e 10% de FBS.
4. Centrifuga-se a 900 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar todas as células em 30 ml de meio. Adicionar 5 ml de meio / poço numa placa de 6 poços e incubar durante 7 dias a 37 ° C e 5% de CO _2.
5. Após a 7 dias de incubação, descartar meios, lavar as células aderentes com 5 ml de PBS morno e adicione 5 ml de meio fresco a cada poço. Permitir que as células crescer até à confluência (aproximadamente 5 - 7 dias), trypsinize, reunir todas as células, e passagem tal como descrito no passo 4.6. células re-placa para placa de 6 poços. Repita este passo três vezes.
6. Depois de três passagens, permitir que as células crescer até à confluência, lavar os poços três vezes com PBS e adicionar 2 ml / poço de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / mL), assegurando que este suporte é livre de FBS. Recolha meios condicionados-linfonodos após 72 horas, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até o uso.
7. Se desejado, confirmar o fenótipo das células dos nodos linfáticos do estroma isoladas (LNSC) utilizando anticorpos contra CD45 e gp38 de rato, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente ^13.

6. Uso de Mídia Organ-condicionado para ensaios a jusante relacionadas com o comportamento metastático das células cancerosas

1. Uma vez que os meios condicionados por órgão foi gerada tal como descrito nos passos 1 - 5, utilizá-lo para levar a cabo a jusante da célula diferente e ensaios de biologia molecular, a fim de determinar a influência de factores derivada de órgãos solúveis sobre o comportamento metastático de células cancerosas. Exemplos de ensaios normalizados descritos noutro local (na literatura) incluem matrizes de proteína ^13, ensaios de crescimento celular ^{13, a migração celular Ensaios 13, tumorsphere formação 14, e RT-PCR 15. Os meios de base original utilizado para gerar o meio condicionado de órgão (ou seja, não condicionado DMEM:. Meio F12 suplementado com 1x concentrada suplemento mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) deve ser usado como um controlo negativo .}

Resultados

Geração de mídia com ar-Organ

Um diagrama / esquemática descrição geral do processo de isolamento de órgãos e geração de meios condicionados é apresentado na Figura 1, com imagens fotográficas representativos do processo mostrado na Figura 2. Deve notar-se que, quando este protocolo foi a primeira fase de desenvolvimento, fígado foi incluído em nossa análise, po...

Discussão

A metástase é um processo complexo pelo qual uma série de eventos celulares são responsáveis ​​por invasão de tecido e tumor distante estabelecimento ^4,30,31. O sistema modelo ex vivo aqui apresentada pode ser utilizada para estudar dois aspectos importantes da progressão metastático: homing célula de cancro ou de migração de um órgão específico ( "chegar") e o crescimento neste órgão ( "crescendo lá"). Muitos estudos têm focado anteriormente na identificaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate