Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Özet

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Özet

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Giriş

Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve kansere bağlı ölümlerin ¹ ikinci önde gelen nedenidir. Meme kanserinin yüksek ölüm oranı azaltmak ve metastatik hastalığı ortadan kaldırmak için konvansiyonel tedavinin başarısızlığı kaynaklanmaktadır; kansere bağlı ölümlerin yaklaşık% 90 metastazı ² kaynaklanmaktadır. Metastatik kaskad altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması erken ve geç evre meme kanserinde hem de etkili tedavilerin gelişmesine için her şeyden önemlidir.

Geçmiş araştırmalar meme kanseri metastazı çok adımlı doğasını aydınlatmak yardımcı oldu ve hem kanser progresyonu ve metastaz sonucu kanser hücreleri ve ana bilgisayar ortamında ³ arasındaki etkileşim üzerine büyük ölçüde bağımlı olduğu varsayılmaktadır. Klinik gözlemler, birçok kanser yani organ tropizmini görüntüler olduğunu göstermektedir., Eğilim tercihli cas organs.In özel metastazMeme kanseri, e, hastanın hastalığı genellikle yayılır ya da kemik, akciğer, lenf bezi, karaciğer ve beyinde ^4-6 olmak üzere 5 ana sitelerine, metastaz. Birçok teori bu süreci açıklamak için geliştirilmiştir, ama sadece birkaç zaman test dayanmış. 1920'lerde önerilen metastaz Ewing teorisi, metastaz thatthe dağılımı mekanik faktörler kesinlikle nedeniyle hipotezi; Tümör hücrelerinin normal tanımlanan fizyolojik kan akışı desenleri ile vücuda taşınır ve sadece birinci kılcal yatakta tutuklama sayede onlar ⁷ karşılaşıyoruz. Buna karşılık, Stephen Paget 1889 "tohum ve toprak" hipotezi ek moleküler etkileşimler hayatta kalma ve metastaz büyümesi, kanser hücreleri ( "tohum") Sadece kendilerini kurmak sayede uygun moleküler faktörler üretmek proliferatein organı mikroçevrelerde ( "toprak sorumlu olduğunu öne ") ^8. Neredeyse bir yüzyıl sonra, Leonard Weiss altındaDaha önce yayınlanmış otopsi verileri bir meta-analiz aldı ve otopsi sırasında tespit edilen birçok metastatik tümörler metastatik bir organ tropizm yalnız kan akımı desenleri ile belirlenmiştir eğer beklenen beklenen oranlarda bulunduğunu Ewing tahminini doğruladı. Ancak, manyinstances sonra Ewing önerdiği mekanik faktörler ⁹ tarafından beklenen bazı sitelere oluşan az veya daha fazla metastaz vardı. Bu hesaplar ve teoriler spesifik organ microenvironments yaygınlaştırma desen ve meme kanseri gibi birçok kanser, sonraki büyüme ve hayatta kalma kritik bir rol oynadığını düşündürmektedir.

Geçmiş araştırma çabaları çoğunlukla tümör hücresi kaynaklı faktörlere odaklanmış ve meme kanseri metastazı ^10-12 gözlenen Organ tropizm katkıları, organ mikroçevresinin türetilmiş ancak az araştırma araştırdı faktörler kurulması için elverişli bir niş sağlayabileceğinigöğüs kanseri metastazlarının. Bu in vitro organ mikroçevresinin bileşenlerini okuyan teknik sorunlar büyük ölçüde kaynaklanmaktadır.

Mevcut madde, insan meme kanseri hücrelerinin, metastatik davranışına lenf nodülü, kemik, akciğer, beyin çözünür bileşenlerin etkisini incelemek için geniş kapsamlı bir ex vivo model sistemi tarif edilir. Daha önce yapılan çalışmalar, farklı meme kanseri hücre çizgileri in vivo metastatik potansiyelin ¹³ tekabül organa koşullanmış ortama karşılık olarak hücre hattı spesifik ve organ spesifik malign davranış gösteren göstererek, bu model sistem onaylamıştır. Bu model sistemi, tanımlamak ve meme ve büyümesi, göçü ile ilgili etkiler de dahil olmak üzere, kanser hücrelerinin diğer türlerine, metastatik davranışında önemli bir rol oynayabilir spesifik organ türetilen çözünür faktörleri değerlendirmek, davranış ve gen ekspresyonu gibi kök için kullanılabilir yanı tespiti olarakkanseri için potansiyel yeni tedavi hedefleri. Bu ayrıntılı olarak organ-spesifik metastatik davranışlarını incelemek için ve kanser metastazı sürecini sürüş organ kaynaklı çözünür faktörlerin rolünü değerlendirmek için kullanılabilecek ilk ex vivo model sistemidir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Western University Hayvan Kullanımı Alt Komitesi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde, Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tavsiyeleri doğrultusunda yapılmıştır.

1. Organ izolasyonu (Akciğer, beyin, kemik, lenf nodu)

1. Dört steril 50 ml konik tüp hazırlanması steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde yaklaşık 30 ml ihtiva eden (Her organ için bir izole edilebilir). bir elektronik terazi kullanılarak PBS her tüp önceden tartın.
2. CO ₂ inhalasyon yoluyla 6-12 haftalık fare Euthanize. 2 dakika veya fare hareket ve nefes durana kadar - Fareler yaklaşık 1 CO ₂ odasında bırakılmalıdır. bir parmak ile el kontrol edildiğinde Başarılı ötenazi ayrıca kalp atışı eksikliği ile teyit edilebilir. Bu yöntem koltuk altı lenf düğümleri kaldırarak zorluk giden boyun kan damarları yırtılabilir olarak servikal dislokasyon kaçının.
   Not: Önceki iş özel kullandısağlıklı kadın çıplak fareler, Hsd: Atimik Nude- Foxn1 ^{nu 13.}
3. Steril doku kültürü kaputu, bir polistren köpük pedi üzerinde sırtında fare koyun uzuvları yaymak ve yerinde tutmak için işaretçilerine kullanın.
4. Steril forseps ve makas kullanılarak, genital de orta hatta karın cildi kesip ağzına doğru yukarı kesti. Yavaşça karın kasları gelen karın cildi geri çekin ve polistren köpük yastığı yerinde pin.
5. aksiller, brakial ve kasık lenf düğümleri bulun.
   Not: Lenf düğümleri genellikle yağ dokusu ile çevrilidir. kasık lenf nodları geri çekti karın cilt üzerinde iki kan damarlarının kavşakta yüzeysel buldum gibi bulmak için en kolay olanıdır. Aksiller ve brakiyal lenf düğümleri doku içinde derin bulunduğu ve doku yumuşak manevra gerektirir.
   1. Eğer lenf nodları bulduktan sonra, yavaşça ve dikkatle lenf hiçbir kesmek için makas kullanındes uzakta deri, yağ ve damarlardan ve fare çıkarın. Uygun diseksiyon onaylamak kaldırılan doku üzerinde forseps rulo. doku üzerinde forseps haddeleme zaman sert yumru varsa, o zaman bir lenf nodu olasılıkla başarıyla kaldırıldı.
   2. buz gibi soğuk PBS çıkarıldı lenf nodları yerleştirin.
6. forseps ve makas kullanılarak, göğse doğru bir yukarı yönlü hareket maruz karın duvarından keserek karın boşluğuna açın. Dikkatle göğüs boşluğu açığa sternum kesti.
7. akciğerlerin altındaki diyafram bulun ve diyaframı kesti. Nedeniyle gerginlik kaburgaların doğru çekmek gerekir.
8. alttan akciğerlere kaldırın ve trakea karşı yatan doku kesti. Bu akciğerler göğüs boşluğundan serbestçe çıkarılmasını sağlar. Buz gibi soğuk PBS blokla en place kalp ve akciğerler çıkarın. Kalp akciğerlerde burada ya da sadece 2. Adımda ağırlığında önce kaldırılabilir.
9. Kaldırpim, polistiren köpük yastığı yerinde fare tutmak. fareyi ters çevirin ve yan kanadına karşısında alt sırt tüm yol cilt kesti.
10. gazlı bez steril bir parçası kullanarak, fare gövdesini tutun fare bacak ve ayakları üzerinde farenin arka cilt soyma.
11. steril gazlı bez aynı parça kullanılarak, dikkatli bir şekilde, yerinde alt bacak tutun fare ayak bileği eklemini kırmak ve diz ekleminin doğru proksimal eklem üzerindeki deriyi soyma.
12. makas kullanarak, buz gibi soğuk PBS diz eklemi ve yerden serbest tibia çıkarın.
13. Tekrarlayın ters ekstremite ile) 1.12) 1.11 yineleyin.
14. forseps kullanarak, yerinde femur tutmak makas kullanarak kas dokusu etrafındaki kesip ve buzla soğutulmuş PBS içinde yerleştirerek, femur çıkarın.
15. ters bacak ile adımı yineleyin 1.14).
16. steril gazlı bez yeni bir parça kullanarak, yerinde farenin kafasını tutun. forseps ve makas kullanarak, yavaşça s maruz cilt kaldırmakKull. makas kullanarak, dikkatle arka beyin ortaya çıkarmak için bir düz ve aşağı çizgide üst merkezden oksipital kafatası kesti.
17. forseps kullanarak, öne doğru beynin altında kepçe ve tüm beyin kaldırmak. buz gibi soğuk PBS beyin yerleştirin.
18. en az dört fareler adımlarını 1.1) 1.17) tekrarlayın.

Tartım 2. Organ

1. Organ izolasyon ardından, elektronik terazi kullanılarak akciğer ve beyin dokusunu içeren her PBS tüpü tartın.
2. PBS tüp + organların (akciğer ve beyin) ağırlığı öncesi izolasyon ağırlığını (PBS yalnızca) çıkarılarak ağırlık farkını hesaplayın.
3. hesaplanan ağırlık farkı doku parçaları tekrar süspansiyon için gerekli ortamın miktarını belirler.
   Not: Akciğer ve beyin dokusu, 4 tabanda ise ağırlığı normalize şunlardır: 1: medya dokusu oranı (hacim / ağırlık).

Içimize ve BEYNİ koşullu ortamın 3. Nesil

1. steril tSorun kültür davlumbaz, kan içeren organ ve aspirat PBS kalıntı kanı çıkarmak için akciğer ve beyin üç kez içeren PBS tüpler ters. Çözelti kan bulgusu net görünene kadar taze soğuk PBS ile tekrarlayın.
2. Ayrı 60 mm ² cam petri kaplarına akciğerleri ve beyinleri yerleştirin. Doku parçaları boyutu yaklaşık ~ 1 mm ³ kadar tekrar tekrar ileri geri dilimleme iki steril neşter bıçak, kıyma akciğerler veya beyin kullanma.
3. Yeniden süspanse doku parçaları uygun hacimde Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde (adım 2.3 önceden belirlenmiş): 1x ile desteklenmiş F12 ortamı mitojen ek ve penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / mi) konsantre edildi.
4. 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna yeniden süspanse akciğer veya beyin dokusu parçaları ekleyin.
5. 37 ° C'de 24 saat% 5 _CO2 medyada doku parçaları inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir doku ve F ortamla toplamakurther 50 ml konik tüp içinde taze medya üç eşdeğer hacimleri ekleyerek sulandırmak.
6. 15 dakika boyunca 4 ° C 'de Her organ için seyreltilmiş şartlandınlmış ortam içindeki 1,000 x g'de santrifüjleyin büyük doku çöküntüsü ortadan kaldırılmaktadır. Medya süpernatant toplayın ve 0.22 mikron şırınga filtre ile filtre.
7. Havuz her organ medya klimalı (yani., Beyin ile akciğer ve beyin ile akciğer) birden fazla farelerden alınan fare to-fare değişkenliği hesaba. Kısım ve mağaza kullanılana kadar -80 ° C 'de ortamla.

Kemik İliği klimalı Medya 4. Nesil

1. Steril doku kültürü kaputu, kemik aşırı doku Döşeme ve makasla kemiklerinden epifizine (uç parçaları) çıkarın.
2. Her kemiğin merkezi aracılığıyla PBS 1 ml iterek kemiklerin bir 27 ½ G iğne, floş medüller kanalı kullanma. Bu PBS içeren yeni bir tüp içine kemik iliği stromal hücreleri (BMSC) toplamak için izin verecektir.
3. 1,00 santrifüj0, 4 ° C'de 5 dakika boyunca xg ve iki kez PBS ile BMSC yıkayın. Kemik stromal hücre büyüme ortamı, 20 ml içinde süspanse kemik iliği stromal hücreleri (DMEM: 1X ile desteklenmiş F12 ortamı mitojen ek, penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / ml) ve% 10 cenin Boven serumu (FBS) konsantre edildi ).
4. Plaka, bir T75 şişesi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, kemik iliği stromal hücreleri, 10 ml.
   Not: Her T75 şişesi içinde her 2 farelerinin birleştirin ve plaka hücreleri; dört fareden, iki T75 şişesi (yaklaşık olarak 1 x 10 ⁷ hücre / şişe) ihtiyaç vardır.
5. 37 ° C'de 24 saat süre ile, kemik stromal hücre büyüme ortamı içinde kemik iliği stromal hücreleri inkübe ve% 5 _CO2. inkübasyonu takiben, her iki T75 şişeler medya kaldırmak ve yeni T75 şişeye koymak, "Floater Flask" olarak bu şişeyi etiketlemek. Önceki 2 matara taze kemik stromal hücre büyüme ortamı ekleyin ve CO ₂ 37 ° C'de 3 şişeler inkübe ve% 5.
6. 7 - Hücreler yaklaşık% 70 confluency (yaklaşık 5 ulaştıktan sonragün) geçiş hücreleri. Bunu yapmak için, orta kaldırmak ve PBS (3 mi, her yıkama) ile iki kez yıkama hücreleri. bu tripsin sağlanması şişenin tüm yüzeyini kaplamaktadır, PBS çıkarın ve tripsin / EDTA solüsyonu 3 ilave edin. Hücreler balon kaldırın sonra (~ 2 - 3 dk),) 3 ml kemik stromal hücre büyüme ortamı ekleyerek trypsinization reaksiyonu durdurun. Santrifüj 900 xg 4 ° C'de 5 dakika boyunca, taze kemik stromal hücre büyüme ortamı, 10 ml ortam ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
7. Bütün şişeler ve geçiş 1 Havuz hücreleri: 5 üç yeni T75 şişeleri içine ve 37 ° C 'de inkübe etmek ve% 5 _CO2. Hücreler bir kez daha% 70 ulaştıktan sonra, adım 4.6 ve havuz ve pasaj tüm yapışık hücreleri ikinci kez tekrarlayın. Yeniden plaka dört T75 balonlarına hücre ve 37 ° C ve% 5 _CO2 inkübe edin. Kemik stromal hücre büyüme ortamı tüm adımlar için kullanılmalıdır.
8. hücreler kemik stromal hücre toplama medya, izdiham ulaşmak PBS ile hücreler üç kez yıkayın ve eklemek için izin (DMEM: F12 medya + 1x konsantre mitojen supplement + penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (ug / ml 50 ug); Bu medya FBS serbest olduğundan emin olduktan 10 ml / T75). 72 saat sonra, kemik iliğinden koşullu ortam toplama, kullanılana kadar -80 ° C de 0.22 mikron filtre, havuz, kısım ve mağaza üzerinden filtre edin.
9. İstenirse, daha önce ¹³ açıklandığı gibi tekniklerle sitometri standart akışını kullanarak fare Sca-1, CD105, CD29 ve CD73, CD44, karşı antikorlar kullanılarak izole kemik iliği stromal hücreleri (BMSC) fenotip onaylayın.

Lenf nodu durumunu Medya 5. Nesil

1. Steril doku kültürü kaputu, lenf düğümleri ve aspirat kanlı PBS kalıntı kanı çıkarmak için lenf düğümleri üç kez içeren PBS tüp ters. Çözelti kan bulgusu net görünene kadar taze soğuk PBS ile tekrarlayın.
2. 60 ^mm2 cam Petri kapları içinde lenf düğümleri yerleştirin. art arda Tissu'nun kadar ileri geri dilimleme iki steril neşter bıçak, kıyma lenf düğümleri kullanarakE fragmanları büyüklüğü yaklaşık ^olarak 1 ^mm3 bulunmaktadır.
3. Konik bir tüp içinde, Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640), penisilin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş ortam / streptomisin (50 ug / ml), 5 x 10 ⁵ M, steril β-merkaptoetanol, 10 ml içinde süspanse doku parçaları ( 1.75 ul / 500 mi ortam) ve% 10 FBS.
4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 900 x g'de santrifüj ve 30 ml ortam tüm hücreleri tekrar süspansiyon. 5 mi ortam / oyuk, 6 oyuklu plaka ekleyin ve 37 ° C'de 7 gün% 5 _CO2 inkübe edilir.
5. 7 gün kuluçkadan sonra, ortam iptal 5 ml ılık PBS ile yapışmayan hücreler yıkayın ve her bir oyuğa, 5 ml taze ortam ilave edin. Aşama 4.6 de tarif edildiği gibi, tüm hücreleri, - (7 gün, yaklaşık 5) tripsinize havuz, ve geçiş hücreleri konfluansa kadar büyümeye olanak sağlar. 6-iyi levhaya yeniden plaka hücreleri. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
6. Üç geçiş sonrası, PBS ile üç kez yıkanır ve ekleme, hücreler birleşecek şekilde büyümesine izin 2 ml / yuva DMEM: F12 + 1 xBu ortam FBS serbest sağlamak konsantre mitojen takviyesi ve penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / ml). kullanılıncaya kadar -80 ° C'de 72 saat, havuz, kısım, ve mağaza sonrası lenf nodu klimalı ortamları toplayın.
7. İstenirse, daha önce ¹³ açıklandığı gibi tekniklerle sitometri standart akışını kullanarak fare CD45 ve gp38, karşı antikorlar kullanılarak izole lenf nodu stromal hücreleri (LNSC) fenotip onaylayın.

Kanser Hücreleri Davranış İle İlgili Alt Tahliller için Organ durumunu Medya 6.

1. 5, kanser hücrelerinin metastaz davranışına çözünebilir organa türetilen faktörlerin etkisini belirlemek amacıyla, farklı alt-hücre ve moleküler biyoloji deneyleri gerçekleştirmek için kullanmak - organa koşullu ortam sonra adım 1 'de tarif edildiği gibi oluşturulmuştur. Literatürde (başka bir yerde tarif edilmiştir), standart analizlere örnekler, protein dizileri ^13, hücre büyümesi tahlilleridir ^{13, hücresel yayılmaya tumorsphere oluşumu 14, 13 deneyleri ve RT-PCR ile 15. Orijinal baz ortamı (organa koşullu ortam üretmek için kullanılır, yani, koşulsuz DMEM. 1x ile takviye F12 ortamı) mitojen ek ve penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / ml konsantre bir negatif kontrol olarak kullanılmalıdır .}

Sonuçlar

Organ koşullu ortamın oluşturulması

Organ izolasyonu ve koşullu ortam üretmede bir genel şema / şeması, Şekil 2'de gösterilen prosedür Örnek fotoğraf görüntüleri, Şekil 1 'de sunulmuştur. Protokol önce gelişme altında olan, karaciğer dahil olduğu not edilmelidir bizim analizde meme kanseri metastazı ortak bir sitedir çünkü. Bununla birlikte,...

Tartışmalar

Metastaz hücresel bir dizi etkinlik doku invazyonu ve uzak tümör kurulması ^4,30,31 sonuçta sorumlu olduğu bir karmaşık bir süreçtir. Bu organın belirli bir organ ( "getting there") ve büyüme ( "Orada büyüyen") kanser hücresi güdümlü ya da göç: Burada sunulan ex vivo model sistem metastatik ilerlemesi iki önemli yönlerini incelemek için kullanılabilir. Birçok çalışma, daha önce metastaz sürecine katkıda kanser hücrelerinin kendileri ile ilgili anaht...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate