유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성

요약

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

초록

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

서문

유방암은 여성에서 가장 흔히 진단 암 및 암 관련 사망의 제 ¹ 원인이다. 유방암의 높은 사망률 완화 및 전이성 질환을 제거하기 위해 통상적 인 치료 실패 주로이고; 암 관련 사망의 대략 90 ^%가이 전이에 기인한다. 전이성 캐스케이드의 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 초기와 후기 단계의 유방암 모두에 효과적인 치료제의 개발에 매우​​ 중요합니다.

최근 연구는 유방암 전이의 다단계 특성을 규명 도왔다하고 두 암의 진행과 전이의 결과 암세포 호스트 환경 ⁽³⁾ 사이의 상호 작용에 따라 크게 좌우된다는 가설이다. 임상 관찰은 많은 암 즉, 장기 친 화성을 ​​표시 있음을 나타냅니다., 경향이 우선적으로 캐스 organs.In 특정에 전이하기유방암의 예는 환자의 질병은 일반적으로 전파 나 뼈, 폐, 림프절, 간, 뇌 ^4-6 포함한 5 개의 주요 부위로 전이된다. 많은 이론이 과정을 설명하기 위해 개발되었지만, 몇 시간의 시험을 견뎌왔다. 1920 년대에 제안 전이 유잉의 이론은, 전이 thatthe 분포는 기계적인 요인에 엄격 때문 가정; 종양 세포가 정상 정의 생리 혈액의 흐름 패턴에 의해 몸 전체에 실시 단순히 첫 번째 모세관 침대에 체포되어 이에 그들은 ^7을 발생합니다. 반면에, 스티븐 파 제트 1889 "종자 및 토양"가설은 추가 분자 상호 작용이 생존과 전이의 성장, 암세포는 ( "씨") 만 자신을 설정할 수있다 적절한 분자 요소를 생산 proliferatein 기관의 미세 환경 ( "토양에 대한 책임이 제안 ") ^8. 거의 한 세기 후, 레너드 와이즈에서이전에 출판 부검 데이터의 메타 분석했다 부검시에 검출 된 다수의 전이성 종양 전이 장기 향성 단독 혈류 패턴에 의해 결정된 경우 예상되는 예상 비율로 발견되었다는 유잉 예측을 확인 하였다. 그러나 manyinstances에 다음 유잉 제안 기계 요소 ^(9)에 의해 예상되는 특정 사이트에 형성된 적은 이상의 전이가 있었다. 이러한 계정과 이론은 특정 장기의 미세 환경이 보급 패턴과 유방암 등 많은 암의 이후의 성장과 생존에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다.

과거의 연구 노력은 주로 종양 세포 유래 인자에 집중하고 유방암 전이 ^10-12에서 관찰 장기 향성 대한 기여는 장기 미세로부터 유래하지만 약간의 연구 탐구되었다 요인 설립 유리한 틈새를 제공 할 수 있다는유방암 전이. 이는 시험관 내에서의 미세 기관의 성분을 연구의 기술적 문제에 주로 기인한다.

현재 문서 인간 유방암 세포의 전이 거동에 림프절, 뼈, 폐, 뇌의 용해 성분의 영향을 연구하기위한 광범위한 생체 모델 시스템을 설명한다. 이전의 연구는 다양한 유방암 세포주가 생체 전이성 전위 ^(13)에 대응하는 장기 조정 배지에 응답 세포주 특정 및 기관 특이 악성 동작을 표시하는 것을 증명함으로써이 모델 시스템을 검증했다. 이 모델은 시스템 식별 및 유방암의 성장, 이동에 영향을 포함한 암 세포의 다른 유형의 전이 동작 역할을하는 특정 장기 유래 가용성 인자를 평가하고, 행동 및 유전자 발현 등을 막기 위해 사용될 수있다 도의 확인 등암에 대한 잠재적 인 새로운 치료 목표. 이를 상세히 기관 특이 전이 거동을 연구하고, 암전이 과정을 구동하기에 장기 유래 가용성 인자의 역할을 평가하기 위해 사용될 수있는 제 체외 모델 시스템이다.

프로토콜

모든 동물 실험은 웨스턴 대학의 동물을 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시 하였다.

1. 장기 격리 (폐, 뇌, 뼈, 림프절)

1. 네 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 준비 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 약 30 ㎖를 함유하는 (각 오르간을 격리 함). 전자 저울을 사용하여 PBS의 각 튜브를 미리 무게.
2. CO ₂ 흡입 6~12주 된 마우스를 안락사. 2 분 또는 마우스를 이동하고 호흡이 멈출 때까지 - 마우스는 약 1의 CO ₂ 챔버에 남아있을 것이다. 손가락으로 직접 확인 성공하면 안락사 더 박동의 부족에 의해 확인 될 수있다. 이 방법은 겨드랑이 림프절을 제거하는 어려움을 선도 목의 혈관을 파열 수 있으므로 자궁 전위를 피하십시오.
   참고 : 이전 작업은 구체적으로 사용하고있다건강한 여성 누드 마우스, HSD : 무 흉선 Nude- Foxn1 ^{뉴 13.}
3. 무균 조직 배양 후드에서, 폴리스티렌 폼 패드의 뒷면에 마우스를 올려 사지를 확산 장소에 보관하는 핀을 사용합니다.
4. 멸균 집게와 가위를 사용하여, 성기의 중간 선에서 복부 피부를 잘라 입으로 위쪽으로 잘라. 조심스럽게 복부 근육의 복부 피부를 뒤로 당겨 폴리스티렌 폼 패드의 위치에 핀.
5. 겨드랑, 상완 및 서혜부 림프절을 찾습니다.
   참고 : 림프 노드는 일반적으로 지방 조직에 의해 둘러싸여있다. 사타구니 림프절들은 철수 복부 피부에 두 개의 혈관의 교차점에 표면적으로 발견으로 찾을 수있는 가장 쉬운입니다. 겨드랑이와 상완 림프 노드는 조직 내에서 깊이있는 조직의 부드러운 기동을 필요로한다.
   1. 당신이 림프절을 찾은 후, 부드럽게 조심스럽게 림프를 더 잘라 가위를 사용하지데스 멀리 피부, 지방, 혈관에서 마우스에서 제거. 적절한 절개를 확인 제거 된 조직을 통해 집게를 출시합니다. 조직 위에 나이프 압연시 하드 덩어리가 존재하는 경우, 림프절 가능성이 성공적으로 제거되었다.
   2. 얼음 차가운 PBS에서 제거 된 림프절을 놓습니다.
6. 집게와 가위를 사용하여 가슴으로 상향 움직임에 노출 된 복부 벽을 절단하여 복강을 엽니 다. 조심스럽게 흉강을 노출, 흉골을 통해 절단.
7. 폐 아래의 다이아 프램을 찾아 조리개를 잘라. 이 때문에 장력에 갈비뼈쪽으로 당겨해야합니다.
8. 아래에서 폐를 들어 올리고 기관으로 기본 조직을 잘라. 이는 폐는 흉강로부터 자유롭게 제거 될 수있다. 얼음 차가운 PBS에서 블록과 장소 실내 심장과 폐를 제거합니다. 심장은 폐 여기하거나 2 단계에서 계량하기 전에 제거 될 수있다.
9. 제거핀 폴리스티렌 폼 패드의 위치에 마우스를 유지. 위에 마우스를 켜고 측면이 측면에하는 맞은 편에 뒷면 하단 끝까지의 피부를 잘라.
10. 거즈의 멸균 조각을 사용하여, 마우스의 몸통을 잡고 마우스의 다리와 발 위에 마우스의 뒤쪽 피부를 벗겨합니다.
11. 멸균 거즈 같은 조각을 사용하여 조심스럽게 자리에 낮은 다리를 잡고 마우스 다리의 발목 관절 휴식과 무릎 관절을 향해 근위 관절을 통해 피부를 벗겨.
12. 가위를 사용하여, 얼음 차가운 PBS에서 무릎 관절과 장소에서 무료로 경골를 제거합니다.
13. 반복 반대 사지로) 1.12에) 1.11 단계를 반복합니다.
14. 집게를 사용하여, 장소에 대퇴골을 가지고 가위를 사용하여 근육 조직을 둘러싼 절단 차가운 PBS 얼음에 배치, 대퇴골를 제거합니다.
15. 반대 다리와 단계를 반복 1.14).
16. 멸균 거즈의 새로운 조각을 사용하여 위치에 마우스의 머리를 잡아. 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게들 노출 피부를 제거컬 소장. 가위를 사용하여 조심스럽게 후방 뇌를 노출 직선과 아래쪽 라인의 상단 중앙에서 후두부 두개골을 잘라.
17. 집게를 사용하여 전방을 향해 뇌의 아래에 특종과 전체 뇌를 제거합니다. 얼음 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다.
18. 적어도 네 마우스에 대한 단계 1.1) 1.17에)를 반복합니다.

무게 2. 장기

1. 장기 분리 후, 전자 저울을 사용하여 폐 및 뇌 조직을 포함하는 각 튜브를 PBS 무게.
2. PBS를 튜브 + 기관 (폐 및 뇌)의 중량으로부터 미리 분리 체중 (PBS 만) 뺀 중량 차이를 계산한다.
3. 계산 된 무게 차이로부터 조직편을 재현 탁에 필요한 용지의 양을 결정한다.
   참고 : 폐와 뇌 조직은 4 재 부유에 의해 정규화 무게 : 1 미디어 : 조직 비율 (부피 / 중량).

폐 - 및 뇌 - 금연실 미디어의 3 세대

1. 멸균 t에서문제 문화 후드는 혈액을 포함하는 기관 및 흡인 PBS에서 잔류 혈액을 제거하기 위해 폐 또는 뇌 세 번을 포함하는 PBS 튜브를 반전. 솔루션은 혈액의 증거와 명확한 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다.
2. 별도의 60mm ² 유리 페트리 접시에 폐와 뇌를 놓습니다. 조직 절편의 크기가 약 ~ 1mm ³ 때까지 반복적으로 앞뒤로 슬라이스하여 두 멸균 메스 블레이드, 말하다 폐 또는 두뇌를 사용하여.
3. 재현 탁 조직 단편은 해당 볼륨에 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM)의 (단계 2.3에서 이전에 결정된) : 1 배 보충 F12 미디어 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ml)에 집중.
4. 6 잘 플레이트 잘 하나에 재 부유 폐 또는 뇌 조직 조각을 추가합니다.
5. 37 ° C에서 24 시간 5 % CO ₂ 미디어에서 조직 조각을 품어. 배양 후, 각 조직과 f를 위해 미디어를 조절 수집합니다urther 한 50㎖ 원추형 튜브에 신선한 미디어 세 동등한 양을 첨가하여 희석한다.
6. 15 분 동안 4 ° C에서 각 기관에 대한 희석 된 배지에서 1,000 XG에 원심 분리기는 큰 조직 파편을 제거합니다. 미디어 뜨는 수집하고 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 필터링합니다.
7. 수영장은 각 기관에서 미디어를 조절 (예., 뇌와 폐, 뇌와 폐) 여러 마우스의 마우스 투 마우스 변동을 설명 할 수 있습니다. 나누어지는 및 저장은 사용할 때까지 -80 ° C에서 미디어를 조절.

골수 에어컨 미디어의 4 세대

1. 무균 조직 배양 후드에서 뼈의 과도한 조직을 잘라 내고 가위로 뼈에서 이환 (끝 부분)를 제거합니다.
2. 각 골의 중심을 PBS 1 ㎖ 밀어 뼈 ½ 27 G 바늘 플러시 골수 공동 사용. 이는 PBS를 함유하는 신선한 튜브 골수 간질 세포 (BMSC)를 수집 할 수 있도록한다.
3. 1,00 원심 분리기0 4 ° C에서 5 분 XG와 PBS로 두 번 BMSC를 씻는다. 뼈 기질 세포 성장 배지 20ml에 재현 탁 골수 간질 세포 (DMEM은 : 1X 보충 된 F12 배지는 분열 촉진 보조제, 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ml) 및 10 % 태아 보벤 혈청 (FBS)을 농축하여 ).
4. 접시 한 ​​T75 플라스크에 재현 탁 골수 간질 세포 10 ㎖.
   참고 : 각 T75 플라스크에있는 모든 2 마우스에서 결합 및 플레이트 세포; 네 마우스를 들어, 두 개의 T75 플라스크는 (약 1 × 10 ⁷ 세포 / 플라스크)이 필요하다.
5. 37 ° C에서 24 시간 동안 뼈 기질 세포 성장 배지에서 골수 간질 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO _2. 배양 후, 두 T75 플라스크에서 미디어를 제거하고 새로운 T75 플라스크에 넣고, "플로터 플라스크"등이 플라스크 레이블을 붙입니다. 이전 2 플라스크에 신선한 뼈 기질 세포 성장 미디어를 추가하고 CO _2를 37 ° C에서 3 플라스크를 품어 5 %.
6. 7 - 세포는 약 70 % 컨 플루 (약 5에 도달 한 후일) 통로 세포. 이 작업을 수행하려면 미디어를 제거하고 PBS (3 ㎖ 각 세척)로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 트립신을 보장하는 플라스크의 전체 표면을 커버 PBS를 제거하고 트립신 / EDTA 용액 3 ㎖를 추가한다. 세포를 플라스크 리프트 오프 후 (~ 2-3 분)) 3 ㎖ 뼈 기질 세포 성장 배지를 첨가함으로써 트립신의 반응을 멈춘다. 원심 분리는 900 × g으로 4 ℃에서 5 분 동안 새로운 뼈 기질 세포 성장 배지 10ml에 미디어 및 재현 탁 된 세포를 버린다.
7. 모든 플라스크 및 통로 1 풀 세포 : 5 세 개의 새로운 T75 플라스크에 넣고 37 ° C에서 품어 5 % CO _2. 세포가 다시 한 번 70 %에 도달 한 후, 단계 4.6 수영장과 통로 모든 부착 세포를 두 번 반복합니다. 다시 플레이트 네 개의 T75 플라스크에 세포와 37 ° C, 5 % CO _2를 품어. 뼈 기질 세포 성장 매체는 모든 단계에 사용한다.
8. 세포가 뼈 기질 세포 수집 미디어를 합류에 도달 PBS로 세포를 세 번 세척하고 추가 할 수 있습니다 (DMEM : F12 미디어 + 1 배 농축 미토 겐 스와pplement + 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (/ ㎖를 50㎍); 이 매체는 FBS이 없는지 확인하고 10 ㎖ / T75). 72 시간 후 골수 에어컨 미디어를 수집, 사용할 때까지 -80 ° C에서 0.22 μm의 필터, 수영장, 나누어지는 및 저장을 통해 필터링합니다.
9. 원하는 경우, 이전 ¹³ 바와 같이 기술 계측법 표준 흐름을 사용하여 마우스 무서-1, CD105, CD29 및 CD73, CD44,에 대한 항체를 사용하여 분리 된 골수 간질 세포 (BMSC)의 표현형을 확인한다.

림프절 에어컨 미디어의 5 세대

1. 멸균 조직 배양 후드에서, 림프절 및 흡 묻은 PBS에서 잔여 혈액을 제거하는 림프절 세 번을 함유하는 PBS 튜브를 반전한다. 솔루션은 혈액의 증거와 명확한 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다.
2. 60mm ² 유리 페트리 접시에서 림프절를 놓습니다. 반복 tissu 때까지 앞뒤로 슬라이스하여 두 멸균 메스 블레이드, 말하다 림프절을 사용하여E 단편의 크기는 대략 1 내지 ³ mm이다.
3. 원추형 튜브 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (RPMI1640) 페니실린 (50 μg의 / ml)로 보충 된 미디어 / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 5 × ^10-5 M 멸균 β 머 캅토 에탄올 10ml에 재현 탁 조직 절편 ( 1.75 μL / 500 ml의 미디어) 10 % FBS.
4. 4 ° C에서 5 분 900 XG에 원심 분리기 30 ml의 미디어에있는 모든 세포를 재현 탁. 5 ml의 미디어 / 잘 6 웰 플레이트에 추가하고 37 ° C에서 칠일, 5 % CO ₂ 품어.
5. 7 일간 배양 한 후, 미디어를 버리고 5 ml의 따뜻한 PBS에 부착 된 세포를 씻어 각 웰에 5 ml의에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 단계 4.6에 설명 된대로 모든 세포를, - (7 일 약 5)를 Trypsinize 수영장 및 통로 세포가 포화 상태로 성장 할 수 있습니다. 6 웰 플레이트에 다시 플레이트 세포. 이 단계를 세 번 반복합니다.
6. 세 구절 후, PBS로 우물을 세 번 씻어 추가, 세포가 포화 상태로 성장 할 수 있도록 2 ㎖ / 잘 DMEM : F12 + 1 배이 매체는 FBS의 무료 보장 집중 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖). 사용할 때까지 -80 ° C에서 72 시간, 수영장, 나누어지는 및 저장 후 림프절 에어컨 미디어를 수집합니다.
7. 원하는 경우, 이전 ¹³ 바와 같은 기술 표준 유동 세포 계측법을 사용하여 마우스 CD45과 gp38,에 대한 항체를 사용하여 단리 림프절 간질 세포 (LNSC)의 표현형을 확인한다.

암 세포의 전이성 동작에 관련 다운 스트림 분석 실험에 대한 장기 에어컨 미디어 6.

1. 5, 암세포의 전이 거동에 용해 장기 유래 인자의 영향을 결정하기 위해 다른 하류 세포 및 분자 생물학적 분석법을 수행하는 데 사용 - 장기 조정 배지되면 단계 1에 기재된 바와 같이 생성되었다. (다른 문헌에 기재되어 있음) 표준 분석법의 예로는 단백질 어레이 ^(13), 세포 성장 분석을 포함 ^{(13), 셀룰러 이동은 tumorsphere 형성 (14), (13) 분석 및 RT-PCR 15. 원래 기본 미디어 (장기 에어컨 미디어를 생성하는 데 사용 즉, 무조건 DMEM :. 1 배 보충 F12 미디어) 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖를 집중 음성 대조군으로 사용한다 .}

결과

장기 에어컨 미디어의 생성

장기 절연 및 조정 배지의 생성 방법의 개요도 / 개략도는도 2에 도시 된 절차를 나타내는 사진 영상과 함께,도 1에 나타나있다.이 프로토콜 처음 개발되었을 때, 간 포함되었음을 주목해야 분석에서 유방암 전이의 일반적인 위치이기 때문이다. 그러나, 제조 ?...

토론

전이는 세포 일련의 이벤트가 조직의 침략과 먼 종양 설립 ^4,30,31에 대한 궁극적 책임이있는 복잡한 과정이다. 해당 기관의 특정 기관 ( "거기에 도착")과 성장 ( "가 성장")에 암 세포 유도 또는 마이그레이션 : 여기에 제시된 생체 모델 시스템은 전이성 진행의 두 가지 중요한 측면을 연구하는데 이용 될 수있다. 많은 연구는 이전 전이 과정에 기여 암세포 자체와 연관?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate