一个<em&gt;体外</em鼠类的椎间盘&gt;器官培养模型

摘要

椎间盘（IVD）的整个器官培养保留天然的细胞外基质，细胞的表型，和细胞 - 基质相互作用。在这里我们将介绍使用鼠标腰部，并在其脊柱功能单位尾椎的IVD并利用该系统的几个应用的IVD文化体系。

摘要

椎间盘（IVD）变性是一个显著贡献腰痛。体外诊断是用于传输和抑制负荷在脊椎关节的纤维软骨。的IVD由富含蛋白聚糖髓核（NP）和通过软骨端板夹在中间的富胶原蛋白的纤维环（AF）的。连同相邻椎骨，椎骨-IVD结构形成功能性脊柱单元（FSU）。这些微结构包含独特的细胞类型，以及独特的细胞外基质。的FSU的整个器官培养保留天然的细胞外基质，细胞分化的表型，和细胞 - 基质相互作用。因此，器官培养技术是用于研究IVD的复杂生物学机制是特别有用的。在这里，我们描述了整个培养腰鼠标FSU的，它为研究疾病机理和治疗的IVD的理想平台的高通量方法。此外，我们描述了小号利用此器官培养方法进行进一步的研究，其中包括对比增强显微CT成像和IVD的三维高分辨率有限元建模everal应用程序。

引言

腰痛（LBP）是全球残疾和工作场所的主导因素生产力损失，以及单独的美国人超过50十亿美元花费在治疗腰痛^1。虽然普遍，LBP的病因仍然是复杂和多因素。然而，椎间盘（IVD）退变是LBP ²最显著的危险因素之一。

的IVD由三个微观结构:外纤维环（AF）中，内部髓核（NP），以及近端和远端³夹住整个结构的两个端板软骨。与衰老和变性，所述IVD部件结构上发生变化，在组成上，并机械^4。这些变化包括在NP蛋白聚糖和水合的损失，椎间盘高度降低，恶化机械能力^5。这些改变是常伴促进炎症反应，以及嗜中性粒细胞和背根神经节侵入到关节间隙中，导致LBP症状⁶事件的级联最终细胞因子。

研究IVD变性的机制是在人类中具有挑战性，因为它往往是不可能的腰背痛发生前到变性的原因隔离。因此，简化了实验系统下到IVD器官的还原方法允许原因变量的机械微调和检查其下游效应^5。该系统被减少到只有天然细胞群和周围的细胞外基质，从而使的外部刺激对IVD退化的影响的直接解释。此外，更低的成本和小鼠模型的可扩展性，以及大量的转基因动物^7，允许吨体外诊断退行性机制和潜在的治疗，他迅速有针对性的筛选。在这里，我们描述了其中IVD细胞和组织稳定性被保持超过21天，给予体外诊断稳态，机械，结构，和炎性样式向特定焦点鼠器官培养系统。使用这种方法，我们重点监测的体外诊断试剂在刺致损伤模型⁸功能的改变，了解背后的椎间盘退变的机制。此外，我们描述这个器官培养方法的几个应用程序，以进行进一步的研究，包括对比增强显微CT成像和IVD的三维高分辨率模型。

研究方案

所有的动物实验均按照圣路易斯动物研究委员会的华盛顿大学进行。

1.动物

1. 获得的小鼠的两个菌株:10周龄的BALB / C（N = 6，BALB-M，BALB / cAnNTac）和10周龄核因子kappa-B-萤光素酶报道动物（NF-κβ-LUC）饲养在的BALB / c背景（N = 6，BALB / C-TG（RELA-LUC）31Xen）。
2. 之前夹层，在2.5-3升/分钟的流速进行5分钟，然后停留时间的另外的2分钟安乐死与CO ₂过量的动物。
3. 通过在70％乙醇浴洗澡它解剖前2分钟消毒动物的外侧区域。

2.解剖

1. 使用小清扫剪刀，以暴露所述体腔的小鼠的背部表面上的纵向垂直切割。
2. 就从开始的动物的脊椎两侧有两条纵向垂直切割所述第一腰椎（L1）到尾椎（C8）。
3. 使用手术刀，细镊子和精细解剖剪刀，小心地从动物的体腔移除L1-C8脊椎。
4. 小心地移除脊柱过量软组织，同时确保不刮擦或损伤的腹侧的IVD。
5. 进一步解剖脊柱到在L1 / L2，L3 / L4，L5 / L6，C3 / C4，C5 / C6和C7 / C8光盘椎骨盘-椎骨脊柱功能装置（FSU）。
6. 冲洗FSU的在补充有1％ - 链霉素青霉素2分钟Hank平衡盐溶液中。
7. 随机指定的FSU的分成三组:未培养的和未处理的FSU的（新鲜），培养的但未治疗FSU的（对照），并培养和刺处理FSU的（刺）。
8. 卡扣冻结在-20℃的冰箱中解剖和存储后立即新鲜FSU样品用液氮。

3.器官培养条件

1. 制备500毫升的无菌培养介质的1:1的Dulbecco改良的Eagle培养基:营养混合物F12（DMEM:F12），补充有20％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素。
2. 用10个毫升血清移液管，移液管2毫升培养基在24孔培养板的每个孔中。
3. 继清扫和冲洗，将每个FSU到个体以及在填充介质的24孔板。
4. 孵育在维持37℃，5％CO _{2，20％O 2}和> 90％的湿度的无菌恒温箱中的样本。
5. 24个小时的初始培养期后，通过机械地使用无菌27号针头， 如图1A中的纤维环的针穿刺伤害刺组的样品。
6. 通过准备新的填充介质的24孔培养板更换介质每48个小时，并转移样品从旧板到新的使用无菌镊子。吸出旧媒体和dispos在生物危险废物箱旧文化板电子。
7. 在培养的最后一天，在孵化介质含有0.75毫克/毫升硝基蓝四唑氯化物24小时的所有样本。
8. 之后，冻结的所有FSU的用液氮并将其存放在-20℃冰箱中，直到准备用于机械试验或组织学（ 图1B）。

4.纵向测量NF-κB

1. 图像的FSU的从NF-κβ萤光素酶在动物1，5，13，和19天评估NF-κB表达。
2. 在37℃下加入1毫克/毫升荧光素溶液10μL至每个孔，并孵育在无菌恒温箱中10分钟。
3. 图像使用成像系统，具有1分钟的曝光时间和第2箱设置用于生物发光的样品。
4. 同时，使用本机拍摄照片，并用生物发光图像覆盖它，以确定在IVD发光的解剖位置。

5。机械评估

1. 通过使用位移控制动态压缩⁹确定体外诊断的机械性能。
2. 使用解剖显微镜，解剖刀，和镊子，同时保持软骨终板完好并连接到IVD从每个样品取出FSU的骨椎体。
3. 附加的分离的体外诊断用氰基丙烯酸酯胶1厘米×1cm的×0.2cm的铝板。
4. 通过采取三次测量的平均使用激光千分尺每个盘的纵向轴线测量的盘的高度和宽度。由最大的光盘宽度除以平均盘高度计算椎间盘高度比率。
5. 使用所测量的盘高度来计算机械测试中使用的输入应变值。另外，平均盘高度约为690微米±39微米。
6. 将磷酸缓冲盐水浴的样品compressi下上机和预加载光盘0.02 N.
7. 在1Hz循环压缩使用正弦波形的光盘为在1％的应变水平20个循环和5％的应变水平为3次试验的每个并记录IVD的负载和位移值。允许试验之间休息时间用于盘放松和防止损伤的10分钟。
8. 计算从上次周期的加载阶段的平均硬度，并计算从负载和位移数据之间的相位角的损耗角正切。

6.蛋白聚糖和胶原蛋白的定量

1. 以下机械测试，通过将所述分离的IVD在预配衡的离心管中，并用分析天平测量重量测量盘湿重。
2. 消化分离的IVD在250μl木瓜蛋白酶消化溶液（0.1M醋酸钠，0.01M EDTA，0.005M的盐酸半胱氨酸，pH值6.4），使用块加热器在65℃下过夜。
3. 10分钟离心分离的样品在2000 XG并收集上清液。
4. 通过使用二甲基亚甲蓝（DMMB）与硫酸软骨素标准测定法测量的IVD的蛋白多糖含量。
5. 制备DMMB溶液（21毫克DMMB，5毫升无水乙醇中，在1升的DDH ₂ O2克甲酸钠）。
6. 移液管的标准30μL和样品中，在96孔板中一式三份，用在每个DMMB溶液250μL以及沿。
7. 读板的吸光度在用分光光度计525纳米。
8. 测量使用根据制造商的说明书一羟脯氨酸测定试剂盒的胶原含量。

7.组织学

1. 固定的样品在4％多聚甲醛的子集24个小时，在5％甲酸去钙化48个小时，用乙醇脱水，并在石蜡中嵌入。
2. 使用切片机，部分样品在矢状位10米微米厚，并应用部分，以载玻片上。染色使用番红O /快Gr而部分EEN和DAPI。
3. 使用光学显微镜，图像滑动在10X放大倍数。

8.对比增强microComputed断层摄影术（微CT）

1. 在使用纵向碘佛醇对比度增强^10，和终端磷钼酸（PMA）对比度增强在7天时间点的0，2,5，和7天的时间点扫描样品的一个子集。
2. 之前微CT扫描时间4个小时，在37℃下添加350毫克/毫升碘佛醇溶液到培养基为大约50毫克/毫升含碘碘佛醇溶液的最终浓度300μL，并培育在无菌恒温箱中4 H。
3. 温育后，包装在1毫升微量离心管中在无菌纱布和代替样品。
4. 在微CT系统的地方样品和扫描在45 keVp，177μA，10.5微米体素尺寸，和300毫秒的整合。
5. 从微型电脑为DICOM文件导出数据和使用软件的可视化（ 例如，OsiriX）。
6. 在7天的时间点，固定使用24小时4％多聚甲醛溶液，接着用5％PMA溶液3天的样品，和扫描使用相同的设置与在步骤8.4中使用。

9.三维有限元建模

1. 段使用的软件有手动阈值（ 例如 ，OsiriX）的体外诊断试剂的DICOM文件。
2. 转换IVD的NP和AF卷成使用Meshlab基于体素的有限元网格。
3. 结合NP和AF的微结构，以形成一个完整的IVD​​和在有限元软件应用通过实验确定的边界条件。

结果

图2-3示出的蛋白聚糖分布，NF-κB表达，刚度，粘度，椎间盘高度，和湿重为培养的小鼠体外诊断的代表性结果。如果适当地培养，对照组的IVD参数不应该从新鲜组显著不同。如果培养物感染或以其它方式受损，对照组将从新鲜组不同，特别是在NF-κB表达和蛋白聚糖分布（未示出结果）。 图器官培养的使用对比增强显微CT获得IVD的三维模型4-5示出的应用程序;?...

讨论

该协议概述了监测在IVD的生物变化鼠FSU的重点器官培养。这些文化的成功维护需要仔细无菌操作技术。特别地，解剖步骤2.1-2.6和培养步骤3.1-3.6需要特别小心，以确保保持在无菌条件，并且这些步骤应当在分离的过程室具有HEPA气流以减少污染物优选进行。由于解剖过程导致的创伤组织中，在3.5的24小时的预处理周期是必需的所有处理组，包括对照。生存力测定法可以用于?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	Midwest Scientific	TP92096	Used for biochemical assays
24 well plate	Midwest Scientific	TP92024	Used for organ culture
25 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94024	Used for organ culture
10 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94010	Used for organ culture
5 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94005	Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm	Midwest Scientific	TP99505	Used for filter media
10 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140098	Used for biochemical assays
200 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140900	Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140920	Used for biochemical assays
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032	Used for culture media
Optiray 350	Guebert	19133341	Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442	Used for culture media
Penicillin Streptomycin	Sigma	P4333	Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride	Sigma	T4375	Used for biochemical assays
D-Luciferin	Sigma	L6152	Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate	Sigma	C9819	Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution	Sigma	HT152	Used for contrast enhanced microCT
Safranin O	Sigma	S8884	diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF	Sigma	F7258	.001% concentration
Papain from papaya latex	Sigma	P3125	Used for biochemical assays
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue	Loctite	234790	Adhesive
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fischer Scientific	S348903	Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent	ActiveLife		For mechanical testing
Cytation 5	Biotek		Spectrophotometer
AxioCam503	Carl Zeiss AG		Microscope
VivaCT40	Scanco		MicroCT
Analytical balance	Denver Instrument Company	A-200DS	Analytical balance
Incubator HERAcell 150i	Thermo Scientific		Organ Culture
Dissection Scope	VistaVision		Used during dissection
Laser Micrometer	Keyence	LK-081	Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R	Eppendorf		Used for biochemical assays
Microtome	Leica	RM2255	Used for histology
Software
Prism 7	GraphPad		For statistics
MATLAB R2014a	Mathworks		For modeling
Osiri-LXIV	Pixmeo		Open Source
MeshLab v1.3.3	Visual Computing Lab - ISTI - CNR		Open Source
PreView/FEBio 2.3	Utah MRL & Columbia MBL		Open Source
ImageJ	NIH
Microsoft Excel	Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02	Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)	Fine Science Tools	14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)	Fine Science Tools	14060-11
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-40	At least 2; can also use #3
Extra Fine Graefe Forceps, serrated	Fine Science Tools	11150-10	At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated	World Precision Instruments	503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth	World Precision Instruments	501244
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel Blades - #23	Fine Science Tools	10023-00
Insect Pins, size 000	Fine Science Tools	26000-25
27 G Needle	BD PrecisionGlide Needles	BD305109