JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

椎間板（IVD）の全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞表現型、および細胞 - マトリックス相互作用を保存します。ここでは、マウスの腰椎とその機能脊髄単位で尾したIVDと、このシステムを利用する複数のアプリケーションを使用してIVD培養系を説明します。

要約

椎間板（IVD）変性が腰痛に多大な貢献です。 IVDは、脊椎の荷重を伝達し、減衰させる働きを線維軟骨関節です。 IVDは、プロテオグリカンが豊富な髄核（NP）と軟骨終板に挟まれたコラーゲンが豊富な線維輪（AF）から成ります。一緒に隣接する椎骨と椎骨-IVDの構造は、機能的脊椎ユニット（FSU）を形成します。これらの微細構造はユニークな細胞型だけでなく、ユニークな細胞外基質が含まれています。 FSUの全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞分化表現型、および細胞 - マトリックス相互作用を保存します。これにより、器官培養技術は、IVDの複雑な生物学的メカニズムを調査するために特に有用です。ここでは、IVDのための病気のメカニズムや治療法を研究するための理想的なプラットフォームを提供し、全体腰椎マウスFSUsを培養するためのハイスループットアプローチを説明します。さらに、我々はSを記述する造影マイクロCTイメージングおよびIVDの三次元高解像度の有限要素モデリングを含む、さらなる研究を行うために、この器官培養法を利用everalアプリケーション。

概要

腰痛（LBP）は、職場での世界的な障害や生産性の損失のための主要な因子であり、そして一人のアメリカ人は、LBP処理1に500億ドルを超えると過ごします。流行が、LBPの病因は複雑かつ多因子のまま。しかし、椎間板（IVD）の変性は、LBP 2のための最も重要な危険因子の一つです。

外側線維輪（AF）、内部の髄核（NP）、及び近位および遠位3全体構造を挟む2つの軟骨終板：IVDは、三の微細構造で形成されています。加齢および変性に、IVD成分は、組成、構造的変化、および機械4。これらの変化は、NPにおけるプロテオグリカン及び水和の損失を含む、椎間板の高さを減少し、機械能力5を悪化。これらの変化はあります多くの場合、炎症反応だけでなく、LBP症状6につながる事象のカスケードで最高潮に達する関節腔への好中球および後根神経節の侵入を促進するサイトカインを伴います。

腰痛の発生前に、変性の原因を特定できないことが多いので、IVD変性のメカニズムを研究することは、ヒトでの挑戦です。このように、IVDの臓器まで実験システムを簡素化するの還元主義的アプローチは因果変数のメカニズムの微調整を可能にし、その下流効果5を調べます。システムは、このようにIVDの変性に対する外部刺激の影響の直接的な解釈を可能にする、唯一のネイティブ細胞集団と細胞外マトリックスを周囲に縮小されます。また、低コスト及びマウスモデルのスケーラビリティ、ならびに遺伝子改変動物7の多数は、Tを可能にします彼IVD変性のメカニズムと潜在的な治療法の迅速な目標スクリーニング。ここでは、IVD細胞および組織安定性たIVD、恒常的、機械的、構造的、および炎症性パターンに与えられる特定の焦点で、21日間にわたって維持されたマウス器官培養系を記載しています。この方法を使用して、我々は、椎間板変性の背後にあるメカニズムを理解するために刺し誘発性損傷モデル8でしたIVD機能の変更を監視します。さらに、我々は造影マイクロCTイメージングおよびIVDの三次元高解像度モデリングを含むさらなる研究を行うために、この器官培養法のいくつかのアプリケーションを記載しています。

プロトコル

全ての動物実験は、セントルイス動物実験委員会のワシントン大学を遵守して行われました。

1.動物

  1. 2系統のマウスを得る：10週齢のBALB / c（N = 6、BALB-M、BALB / cAnNTac）及び10週齢の核因子カッパBルシフェラーゼレポーター動物（NF-κβ-LUC）の上に飼育BALB / cバックグラウンド（N = 6、BALB / C-TG（RELA-LUC）31Xen）。
  2. 解剖前に、時間を住居の追加の2分間、続いて5分間2.5-3リットル/分の流量でCO 2過剰投与して動物を安楽死させます。
  3. 解剖前に2分間70％エタノール浴中に浸すことによって、動物の外側の領域を消毒します。

2.解剖

  1. 体腔を露出させるために小さな切開鋏を用いてマウスの背側表面に縦方向の垂直カットを行います。
  2. から始まる動物の背骨の両側に二つの長手方向の垂直カットを作ります尾椎骨（C8）への最初の腰椎（L1）。
  3. メス、細かい鉗子、細かい解剖ハサミを使用して、慎重に動物の体腔からL1-C8から背骨を取り除きます。
  4. こすり又は腹側のIVDを傷つけないように確保しながら慎重に、脊柱を取り囲む過剰軟組織を除去します。
  5. さらに、L1 / L2、L3 / L4、L5 / L6、C3 / C4、C5 / C6、およびC7 / C8ディスクにおける椎骨ディスク、脊椎の機能的脊椎ユニット（FSUs）に脊柱を解剖。
  6. 1％2分間ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したハンクス平衡塩溶液中FSUsをすすぎます。
  7. 無培養および未処理FSUs（フレッシュ）、培養されたが、未処理FSUs（コントロール）、および培養し、スタブ処理しFSUs（スタブ）：ランダムに三つのグループにFSUsを割り当てます。
  8. スナップは、直ちに-20℃の冷凍庫に解剖して格納した後、液体窒素で新鮮FSUサンプルを凍結します。

3.器官培養条件

  1. 無菌の培養培地の500ミリリットルを調製1：1ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合F12：20％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した（DMEM F12）。
  2. 24ウェル培養プレートの各ウェルに、10mLの血清学的ピペット、ピペット培地の2ミリリットルを使用。
  3. 解剖以下と媒体が充填された24ウェルプレートの個々のウェルに各FSUを配置し、すすぎます。
  4. 37°C、5％CO 2、20％O 2及び> 90％の湿度を維持する滅菌インキュベーター中でサンプルをインキュベートします。
  5. 図1Aに示すように、24時間の初期培養期間後、機械的に無菌の27ゲージ針を使用して、線維輪の針穿刺を介してスタブ群サンプルを傷つけます。
  6. 新しい使用滅菌ピンセットに古いプレートから新しい媒体が充填された24ウェル培養プレートを調製することにより、メディアごとに48時間を変更し、転送サンプル。古いメディアとdisposを吸引バイオハザード廃棄物ビンの古い培養プレートの電子。
  7. 培養の最後の日に、24時間0.75 mg / mlとニトロブルーテトラゾリウムクロリドを含む培地中ですべてのサンプルをインキュベートします。
  8. その後、機械的試験または組織学的検査（ 図1B）の準備ができるまで-20℃のフリーザー中の液体窒素とストアとすべてFSUs凍結。

4.縦測定NF-κB

  1. NF-κBの発現を評価するための1、5、13、および19日目NF-κβルシフェラーゼ動物からの画像FSUs。
  2. 各ウェルに1mg / mlのルシフェリン溶液10μLを添加し、37℃で10分間滅菌したインキュベーター中でインキュベートします。
  3. 画像1分間の露光時間と2のビンの設定と画像化システムを使用して生物発光用のサンプル。
  4. 同時に、写真を撮るとIVDに発光の解剖学的位置を決定するために、生物発光画像とをオーバーレイする機械を使用します。
5。機械的な評価

  1. 変位制御動的圧縮9を用いてたIVDの機械的挙動を決定します。
  2. 解剖顕微鏡、メス、ピンセットを使用して、無傷の軟骨終板を維持しながら、各試料からFSUの骨の椎体を除去し、IVDに取り付けられました。
  3. シアノアクリレート接着剤を使用して1センチメートルX 1センチメートルX 0.2cmのアルミニウム板に単離されたIVDを取り付けます。
  4. レーザーマイクロメータを使用して、各ディスクの縦軸に3回の測定の平均を取ることによって、椎間板の高さと幅を測定します。最大ディスク幅で平均椎間板の高さを分割することにより椎間板の高さの比を計算します。
  5. 機械的試験に使用される入力歪み値を計算するために測定された椎間板の高さを使用してください。平均的な椎間板の高さは約690ミクロン±39μmであったことに留意されたいです。
  6. compressiの下でリン酸緩衝生理食塩浴にサンプルを置き、マシン上と0.02 Nにディスクをプリロード
  7. 周期的に3つの試験それぞれ20 1％の歪みレベルでのサイクルおよび5％の歪みレベルに対して1 Hzでの正弦波形を使用してディスクを圧縮し、IVDの荷重と変位値を記録します。リラックスして、けがを防止するために、ディスクの臨床試験の間の時間を休憩の10分を許可します。
  8. 最後のサイクルのローディング相から平均剛性を計算し、荷重と変位データとの間の位相角の正接を計算します。

6.プロテオグリカンとコラーゲンの定量化

  1. 機械的試験に続いて、プレ風袋遠心管に、単離されたIVDを配置し、化学天秤を用いて重量を測定することにより、ディスク湿重量を測定します。
  2. ブロックヒーターを用いて65℃で一晩250μLで単離されたIVDパパイン消化溶液（0.1 M酢酸ナトリウム、0.01 M EDTA、0.005 MシステインHClを、pHが6.4）を消化します。
  3. 10分間の遠心分離サンプル2,000×gで、上澄み液を集めます。
  4. コンドロイチン硫酸標準とジメチルメチレンブルー（DMMB）アッセイを使用して、IVDのプロテオグリカン含有量を測定します。
  5. DMMB溶液（21 mgのDMMB、5mLの無水エタノールを、1 LのddH 2 O中に2gのギ酸ナトリウム）を準備。
  6. 各ウェル中のDMMB溶液の250μLと一緒に96ウェルプレートに三重で標準および試料のピペット30μL、。
  7. 分光光度計を用いて525 nmでプレートの吸光度を読みます。
  8. 製造者の指示に従ってヒドロキシプロリンアッセイキットを使用してコラーゲン含有量を測定します。

7.組織学

  1. 24時間、4％パラホルムアルデヒド中でサンプルのサブセットを修正し、48時間、5％ギ酸中で脱石灰化、エタノールで脱水し、パラフィンに埋め込みます。
  2. 矢状10μmの厚さでセクション、サンプルをミクロトームを用いて、ガラススライドに切片を適用します。サフラニンO /ファストGrとを使用してセクションを染色EENおよびDAPI。
  3. 光学顕微鏡を使用して、画像は10倍の倍率でスライドします。

8.造影microComputed断層撮影（マイクロCT）

  1. 7日の時点で縦イオベルソールコントラスト増強10、及び末端リンモリブデン酸（PMA）、コントラスト強調を用いて0、2、5、及び7日の時点でサンプルのサブセットをスキャンします。
  2. 前マイクロCTスキャン時間〜4時間、約50ミリグラム/ mLのヨウ素含有イオベルソール溶液の最終濃度のために培地に350 mg / mlとヨウ素イオベルソール溶液の300μLを添加し、4 37℃で滅菌インキュベーター中でインキュベート時間。
  3. インキュベーション後、1 mlのマイクロ遠心チューブに滅菌ガーゼと場所でサンプルを包みます。
  4. マイクロCTシステム内の場所のサンプルと45 keVp、177μA、10.5μmのボクセルサイズ、および300ミリ秒の積分でスキャンします。
  5. エクスポートDICOMファイルなどのマイクロCTからのデータやソフトウェアを使用して可視化します（ 例えば、OsiriXの）。
  6. 7日の時点で、3日間、5％のPMA溶液、続いて24時間、4％パラホルムアルデヒド溶液を用いて試料を固定し、そして工程8.4で使用したものと同じ設定を使用してスキャンします。

9.三次元有限要素モデリング

  1. セグメントマニュアルしきい値（ 例えば 、OsiriXの）でソフトウェアを使用したIVDのDICOMファイル。
  2. IVDのNPとAFボリュームはMeshlabを使用して、ボクセルベースの有限要素メッシュに変換します。
  3. 完全なIVDを形成し、有限要素ソフトウェアで実験的に決定された境界条件を適用するためにNPとAFの微細構造を組み合わせます。

結果

図2-3は、培養マウスたIVD用プロテオグリカン分布、NF-κBの発現、剛性、粘性、椎間板の高さ、及び湿重量の代表的な結果を示します。適切に培養した場合は、コントロール群のIVDパラメータは、新鮮なグループと有意差があってはなりません。培養物が感染または他の方法で侵害された場合、対照群には、（結果は示さず）、特にNF-κBの発現およびプロテオグリカン分布は、新?...

ディスカッション

このプロトコルは、IVDにおける生物学的変化を監視することに重点を置いて、マウスFSUの器官培養の概要を説明します。これらの培養の成功メンテナンスは慎重な無菌技術を必要とします。具体的には、切開は、2.1から2.6ステップと培養物を3.1から3.6の無菌状態が維持されることを保証するために特別な注意を必要とするステップ、及びこれらの手順は、汚染物質を?...

開示事項

この原稿の著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作品は、ワシントン大学の筋骨格系研究センター（NIHのP30のAR057235）、分子イメージングセンター（NIHのP50のCA094056）、メカノトレーニンググラント（NIH 5T32EB018266）、NIH R21AR069804、およびNIH K01AR069116によってサポートされていました。著者は、データ収集の彼の貢献のためのパトリック・ウォン感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well plateMidwest ScientificTP92096Used for biochemical assays
24 well plateMidwest ScientificTP92024Used for organ culture
25 mL pipettesMidwest ScientificTP94024Used for organ culture
10 mL pipettesMidwest ScientificTP94010Used for organ culture
5 mL pipettesMidwest ScientificTP94005Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µmMidwest ScientificTP99505Used for filter media
10 µL pipette tipsMidwest ScientificNP89140098Used for biochemical assays
200 µL pipette tipsMidwest ScientificNP89140900Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tipsMidwest ScientificNP89140920Used for biochemical assays
DMEM/F-12Invitrogen11330032Used for culture media
Optiray 350Guebert19133341Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine SerumSigmaF2442Used for culture media
Penicillin Streptomycin SigmaP4333Used for culture media
Tetrazolium Blue ChlorideSigmaT4375Used for biochemical assays
D-LuciferinSigmaL6152Used for bioluminescence imaging
Chondroitin SulfateSigmaC9819Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid SolutionSigmaHT152Used for contrast enhanced microCT
Safranin OSigmaS8884diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCFSigmaF7258.001% concentration
Papain from papaya latexSigma P3125Used for biochemical assays
DAPISigma-AldrichD9542Nucleic acid staining
Cyanoacrylate GlueLoctite234790Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge TubesFischer ScientificS348903Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDentActiveLifeFor mechanical testing
Cytation 5BiotekSpectrophotometer
AxioCam503Carl Zeiss AGMicroscope
VivaCT40ScancoMicroCT
Analytical balanceDenver Instrument CompanyA-200DSAnalytical balance
Incubator HERAcell 150iThermo ScientificOrgan Culture
Dissection ScopeVistaVisionUsed during dissection
Laser MicrometerKeyenceLK-081Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 REppendorfUsed for biochemical assays
MicrotomeLeica RM2255Used for histology
Software
Prism 7GraphPadFor statistics
MATLAB R2014aMathworksFor modeling
Osiri-LXIVPixmeoOpen Source
MeshLab v1.3.3Visual Computing Lab - ISTI - CNROpen Source
PreView/FEBio 2.3Utah MRL & Columbia MBLOpen Source
ImageJNIH
Microsoft ExcelWindows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools  15000-02Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)Fine Science Tools  14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)Fine Science Tools  14060-11
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools  11252-40At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serratedFine Science Tools  11150-10At least 2
Micro-Adson Forceps, serratedWorld Precision Instruments503719-12
Micro-Adson Forceps, teethWorld Precision Instruments501244
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools  10003-12
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools  10004-13
Scalpel Blades - #23Fine Science Tools  10023-00
Insect Pins, size 000Fine Science Tools26000-25
27 G NeedleBD PrecisionGlide NeedlesBD305109

参考文献

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved