Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Résumé

culture d'organe total du disque intervertébral (DIV) conserve la matrice extracellulaire native, les phénotypes cellulaires, et les interactions entre la matrice cellulaire. Nous décrivons ici un système de culture à l'aide IVD IVD lombaire de la souris et caudale dans leurs unités fonctionnelles de la colonne vertébrale et plusieurs applications utilisant ce système.

Résumé

La dégénérescence du disque intervertébral (IVD) est un facteur important de la lombalgie. L'IVD est un joint fibrocartilagineux qui sert à transmettre et à amortir les charges de la colonne vertébrale. Le IVD se compose d'un noyau riche en protéoglycanes-pulposus (NP) et un anneau fibreux riche en collagène (AF) prise en sandwich par cartilagineux plaques d'extrémité. Ensemble avec les vertèbres adjacentes, la structure des vertèbres-IVD forme une unité de colonne vertébrale fonctionnelle (FSU). Ces microstructures contiennent des types de cellules uniques ainsi que des matrices extracellulaires uniques. culture d'organe plénier de l'ex-URSS conserve la matrice extracellulaire native, phénotypes de différenciation cellulaire, et les interactions à matrice cellulaire. Ainsi, les techniques de culture d'organes sont particulièrement utiles pour étudier les mécanismes biologiques complexes du IVD. Nous décrivons ici une approche à haut débit pour la culture de l'ensemble de la souris FSU lombaire qui offre une plate-forme idéale pour l'étude des mécanismes et des thérapies pour la maladie du IVD. De plus, nous décrivons slusieurs applications qui utilisent ce procédé de culture d'organe de procéder à d'autres études, y compris l'imagerie par microCT contraste amélioré et en trois dimensions à haute résolution modélisation par éléments finis de la IVD.

Introduction

La lombalgie (LBP) est le principal facteur d'invalidité globale et la perte de productivité en milieu de travail, et les Américains dépensent à eux seuls plus de 50 milliards de dollars sur le traitement de la lombalgie ^1. Bien que répandue, l'étiologie de la lombalgie reste complexe et multifactorielle. Cependant, la dégénérescence des disques intervertébraux (IVD) est parmi les facteurs de risque les plus importants pour LBP ^2.

L'IVD est composé de trois microstructures: l'anneau fibreux extérieur (AF), le noyau pulpeux intérieur (NP), et deux plaques d' extrémité cartilagineux qui prennent en sandwich l'ensemble de la structure proximale et distale ^3. Avec l' âge et la dégénérescence, les composants IVD changent de structure, de composition et mécaniquement ^4. Ces changements incluent la perte de protéoglycanes et de l' hydratation de la NP, une diminution de la hauteur du disque, et détériorée compétence mécanique ^5. Ces modifications sontsouvent accompagnée de cytokines qui favorisent une réponse inflammatoire, ainsi que neutrophile et intrusion ganglionnaires racine dorsale dans l'espace articulaire aboutissant à une cascade d'événements qui conduisent à des symptômes de lombalgie ^6.

L'étude des mécanismes de la dégénérescence IVD est difficile chez les humains, car il est souvent impossible d'isoler la cause de la dégénérescence avant l'apparition de la lombalgie. Ainsi, une approche réductionniste de la simplification du système expérimental jusqu'à l'organe IVD permet peaufinage mécaniste des variables de cause à effet et d' examiner leurs effets en aval ^5. Le système est réduit à la seule population de cellules native et entourant la matrice extracellulaire, permettant ainsi l'interprétation directe des effets des stimuli externes sur la dégénérescence IVD. De plus, le coût plus faible et l' évolutivité des modèles murins, ainsi que le grand nombre d'animaux génétiquement modifiés ^7, permettent til rapide dépistage ciblé des mécanismes dégénératifs IVD et des thérapies potentielles. Ici, nous décrivons un système murin de culture d'organe dans lequel IVD stabilité cellulaire et tissulaire est maintenue pendant 21 jours, avec une attention particulière accordée aux IVDS de motifs homéostatique, mécaniques, structurelles et inflammatoires. En utilisant cette méthode, nous surveillons les changements fonctionnels de IVDS dans un modèle de lésion induite par poignarder ⁸ à comprendre les mécanismes de la dégénérescence du disque. De plus, nous décrivons plusieurs applications de cette méthode de culture d'organes pour mener d'autres études, y compris l'imagerie par microtomographie contraste amélioré et trois dimensions de modélisation à haute résolution de l'IVD.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément à l'Université de Washington à St. Louis Comité des études animales.

1. Animaux

1. Obtenir deux souches de souris: vieux BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) et 10 semaines vieux animaux rapporteurs kappa-B-luciférase facteur nucléaire (NF-κβ-luc) à 10 semaines élevé dans une fond BALB / c (n = 6, BALB / c-Tg (Rel-luc) 31Xen).
2. Avant la dissection, euthanasie les animaux avec une surdose de CO ₂ à un débit de 2,5 à 3 L / min pendant 5 min suivie d'un supplément de 2 min de temps de séjour.
3. Désinfecter la région à l'extérieur de l'animal par le baignant dans un bain d'éthanol à 70% pendant 2 min avant la dissection.

2. Dissection

1. Faire une coupe verticale longitudinale sur la surface dorsale de la souris à l'aide de ciseaux de dissection petites afin d'exposer la cavité du corps.
2. Faites deux coupes longitudinales verticales de chaque côté de la colonne vertébrale de l'animal à partir dela première vertèbre lombaire (L1) pour les vertèbres caudales (C8).
3. L'utilisation d'un scalpel, une pince fine, et des ciseaux de dissection fines, retirez délicatement la colonne vertébrale de L1-C8 de la cavité du corps de l'animal.
4. Retirez délicatement les tissus mous qui entourent l'excès de la colonne vertébrale, tout en veillant à ne pas gratter ou blesser l'IVD sur la face ventrale.
5. En outre disséquer la colonne vertébrale dans les unités fonctionnelles de la colonne vertébrale des vertèbres-disque vertèbres (FSU) à L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, et les disques C7 / C8.
6. Rincer le FSU dans une solution saline équilibrée de Hank additionné de 1% de pénicilline-streptomycine pendant 2 min.
7. Attribuer au hasard les FSU en trois groupes: non cultivé et non traité FSU (frais), mais en culture non traitée FSU (témoin), et cultivées et traitées stab FSU (Stab).
8. Aligner congeler les échantillons frais FSU avec de l'azote liquide immédiatement après la dissection et stocker dans un congélateur à -20 ° C.

3. Conditions d'organes Culture

1. Préparer 500 ml de milieu de culture stérile de 1: 1 modifiée du milieu de Eagle de Dulbecco: mélange nutritif F12 (DMEM: F12) complété avec 20% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine.
2. En utilisant 10 ml de pipettes sérologiques, la pipette 2 ml de milieu de culture dans chaque puits d'une plaque de culture 24 puits.
3. À la suite de dissection et de rinçage, placer chaque FSU dans un puits individuel rempli dans le support de plaque à 24 puits.
4. Incuber les échantillons dans un incubateur stérile qui maintient à 37 ° C, 5% CO _2, 20% de O ₂ et> 90% d' humidité.
5. Après une période de culture initiale de 24 h, les échantillons blesser mécaniquement groupe Stab par ponction à l'aiguille de l'anneau fibreux en utilisant une aiguille de calibre 27 stérile comme représenté sur la figure 1A.
6. Changer les médias toutes les 48 h en préparant une nouvelle plaque de culture 24 puits rempli médias, et des échantillons de transfert de l'ancienne plaque à la nouvelle aide de pinces stériles. Aspirer les anciens médias et dispose de la vieille plaque de culture dans un bac à déchets biologiques dangereux.
7. Le dernier jour de culture, incuber les échantillons dans un milieu contenant 0,75 mg / ml de chlorure de nitro bleu de tétrazolium pendant 24 h.
8. Ensuite, geler tous les FSU à l' azote liquide et stocker dans un congélateur à -20 ° C jusqu'au moment de l' essai mécanique ou histologie (figure 1B).

4. Mesures longitudinales NF-kB

1. Image de la FSU des animaux NF-κβ-luciférase à 1, 5, 13, et 19 jours pour évaluer l'expression NF-kB.
2. Ajouter 10 pi de 1 mg / ml de solution de luciférine à chaque puits et incuber dans un incubateur stérile à 37 ° C pendant 10 min.
3. L'image des échantillons de bioluminescence à l'aide du système de formation d'image avec un temps d'exposition de 1 minute et de réglage du bac 2.
4. En même temps, utiliser la machine pour prendre une photo et la superposition avec l'image de bioluminescence pour déterminer la localisation anatomique de la luminescence dans le IVD.

5. évaluation mécanique

1. Déterminer le comportement mécanique des DIV en utilisant la compression dynamique contrôlée ^{déplacement-9.}
2. En utilisant un microscope de dissection, scalpel et des pinces, retirer les corps vertébraux osseux du FSU de chaque échantillon, tout en maintenant les plaques d'extrémité cartilagineuses intact et fixé au IVD.
3. Attacher les DIV isolées à 1 cm x 1 cm x 0,2 cm plaque d'aluminium avec de la colle cyanoacrylate.
4. Mesurer la hauteur du disque et la largeur en prenant une moyenne de trois mesures sur l'axe longitudinal de chaque disque à l'aide d'un micromètre à laser. Calculer le rapport de la hauteur du disque en divisant la hauteur moyenne du disque par la largeur maximale du disque.
5. Utilisez la hauteur du disque mesuré pour calculer les valeurs de contrainte d'entrée utilisées dans les essais mécaniques. Notez que la hauteur du disque moyen était d'environ 690 um ± 39 um.
6. Placer les échantillons dans un bain de solution saline tamponnée au phosphate sous la Compressisur la machine et précharger le disque à 0,02 N.
7. Cycliquement comprimer le disque en utilisant une forme d'onde sinusoïdale à 1 Hz pendant 20 cycles au niveau de déformation de 1% et 5% du niveau de contrainte pour chacun des essais 3 et enregistrer les valeurs de charge et de déplacement de l'IVD. Attendez 10 min de temps de repos entre les essais pour le disque pour se détendre et éviter les blessures.
8. Calculer la raideur moyenne de la phase de chargement du dernier cycle, et le calcul de la tangente de perte à partir de l'angle de phase entre les données de charge et de déplacement.

6. protéoglycanes et du collagène Quantification

1. Suite à des essais mécaniques, mesurer le poids humide du disque en plaçant le IVD isolé dans un tube de centrifugeuse de pré-taré et en mesurant le poids en utilisant une balance analytique.
2. Digérer les DIV isolés dans 250 ul d'une solution de digestion de papaïne (0,1 M d'acétate de sodium, 0,01 M d'EDTA, 0,005 M HCl cysteine, pH 6,4) pendant une nuit à 65 ° C en utilisant un chauffe-bloc.
3. Centrifuger les échantillons pendant 10 minà 2000 xg et recueillir le liquide surnageant.
4. Mesurer la teneur en protéoglycanes du IVD en utilisant le dosage au bleu de diméthylméthylène (DMMB) avec les normes de sulfate de chondroïtine.
5. Préparer la solution de DMMB (21 mg DMMB, 5 ml d' éthanol absolu, 2 g de formiate de sodium dans 1 L ddH ₂ O).
6. Pipeter 30 uL de standards et d'échantillons en trois exemplaires dans une plaque à 96 puits, avec 250 ul de solution de DMMB dans chaque puits.
7. Lire l'absorbance de la plaque à 525 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
8. Mesurer la teneur en collagène en utilisant un kit de dosage hydroxyproline selon les instructions du fabricant.

7. Histologie

1. Fixer un sous-ensemble d'échantillons dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 h, de-calcifier à 5% d'acide formique pendant 48 h, déshydrater avec de l'éthanol, et incorporer dans de la paraffine.
2. En utilisant un microtome, les échantillons section sagittale à 10 um d'épaisseur et d'appliquer les sections de lames de verre. Colorer les sections à l'aide safranine-O / Fast Green et DAPI.
3. L'utilisation d'un microscope optique, glisse image au grossissement 10X.

8. Contraste amélioré microtomographie positons (microtomographie)

1. Balayer un sous - ensemble d'échantillons aux 0, 2, 5, et des points de temps de 7 jours à l' aide de contraste pour l' amélioration Ioversol longitudinal ^10, et le contraste d'amélioration de l' acide phosphomolybdique (PMA) borne au point de temps de 7 jours.
2. 4 h avant le temps de balayage microCT, ajouter 300 uL de 350 mg / ml de solution d'iode Ioversol aux milieux de culture pour une concentration finale d'environ 50 mg / ml solution Ioversol contenant de l'iode et incuber dans un incubateur stérile à 37 ° C pendant 4 h.
3. Après l'incubation, l'échantillon envelopper dans une gaze stérile et on place dans un tube de microcentrifugation de 1 mL.
4. Placer les échantillons dans le système de microCT et numériser à 45 keVp, 177 uA, 10,5 um taille de voxel, et 300 ms intégration.
5. Exporter des données de la microtomographie sous forme de fichiers DICOM et visualiser à l'aide du logiciel ( par exemple, OsiriX).
6. Au point de temps de 7 jours, fixer des échantillons en utilisant une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 24 h, suivi de 5% solution de PMA pendant 3 jours et numériser en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés à l'étape 8.4.

9. Trois dimensions Modélisation par éléments finis

1. Segmenter les fichiers DICOM des IVD en utilisant le logiciel avec seuillage manuel (par exemple, OsiriX).
2. Convertir les volumes NP et AF du IVD en mailles d'éléments finis voxeliques utilisant Meshlab.
3. Combiner les microstructures du NP et AF pour former un IVD complet et appliquer des conditions aux limites déterminées expérimentalement dans le logiciel des éléments finis.

Résultats

Les figures 2-3 montrent des résultats représentatifs de la distribution des protéoglycanes, l' expression du NF-kB, la raideur, la viscosité, la hauteur du disque, et le poids humide pour le diagnostic in vitro de souris en culture. Si cultivées correctement, les paramètres IVD du groupe de contrôle ne doivent pas être significativement différent du groupe frais. Si la culture est infecté ou compromis, le groupe de contrôle sera différent du groupe frais, en particulier dans l'expre...

Discussion

Ce protocole décrit une culture d'organes de l'ex-URSS de souris en mettant l'accent sur le suivi des changements biologiques dans le diagnostic in vitro. Le maintien de succès de ces cultures nécessite une étude minutieuse des techniques stériles. En particulier, la dissection étapes et 2/1 à 2/6 la culture étapes 03.01 à 03.06 ont besoin de soins spéciaux pour assurer des conditions de stérilité soient maintenues, et ces étapes doit être effectuée de préfér...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	Midwest Scientific	TP92096	Used for biochemical assays
24 well plate	Midwest Scientific	TP92024	Used for organ culture
25 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94024	Used for organ culture
10 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94010	Used for organ culture
5 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94005	Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm	Midwest Scientific	TP99505	Used for filter media
10 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140098	Used for biochemical assays
200 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140900	Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140920	Used for biochemical assays
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032	Used for culture media
Optiray 350	Guebert	19133341	Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442	Used for culture media
Penicillin Streptomycin	Sigma	P4333	Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride	Sigma	T4375	Used for biochemical assays
D-Luciferin	Sigma	L6152	Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate	Sigma	C9819	Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution	Sigma	HT152	Used for contrast enhanced microCT
Safranin O	Sigma	S8884	diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF	Sigma	F7258	.001% concentration
Papain from papaya latex	Sigma	P3125	Used for biochemical assays
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue	Loctite	234790	Adhesive
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fischer Scientific	S348903	Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent	ActiveLife		For mechanical testing
Cytation 5	Biotek		Spectrophotometer
AxioCam503	Carl Zeiss AG		Microscope
VivaCT40	Scanco		MicroCT
Analytical balance	Denver Instrument Company	A-200DS	Analytical balance
Incubator HERAcell 150i	Thermo Scientific		Organ Culture
Dissection Scope	VistaVision		Used during dissection
Laser Micrometer	Keyence	LK-081	Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R	Eppendorf		Used for biochemical assays
Microtome	Leica	RM2255	Used for histology
Software
Prism 7	GraphPad		For statistics
MATLAB R2014a	Mathworks		For modeling
Osiri-LXIV	Pixmeo		Open Source
MeshLab v1.3.3	Visual Computing Lab - ISTI - CNR		Open Source
PreView/FEBio 2.3	Utah MRL & Columbia MBL		Open Source
ImageJ	NIH
Microsoft Excel	Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02	Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)	Fine Science Tools	14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)	Fine Science Tools	14060-11
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-40	At least 2; can also use #3
Extra Fine Graefe Forceps, serrated	Fine Science Tools	11150-10	At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated	World Precision Instruments	503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth	World Precision Instruments	501244
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel Blades - #23	Fine Science Tools	10023-00
Insect Pins, size 000	Fine Science Tools	26000-25
27 G Needle	BD PrecisionGlide Needles	BD305109