A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Resumo

cultura de órgão inteiro do disco intervertebral (IVD) preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos celulares, e interacções de matriz celular. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura IVD utilizando lombar do mouse e IVDs caudal em suas unidades da coluna vertebral funcionais e várias aplicações que utilizam este sistema.

Resumo

degeneração do disco intervertebral (IVD) é um contribuinte significativo para a dor lombar. O IVD é uma joint fibrocartilaginous que serve para transmitir e amortecer cargas na coluna vertebral. O IVD consiste de um pulposo rica em proteoglicanos núcleo (NP) e um anel fibrose rico em colagénio (AF) ensanduichado por placas terminais cartilaginosas. Juntamente com as vértebras adjacentes, a estrutura vértebras-IVD forma uma unidade funcional coluna (FSU). Estas microestruturas contêm tipos de células únicas, bem como matrizes extracelulares únicas. cultura de órgão inteiro do FSU preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos de diferenciação celular, e interacções de matriz celular. Assim, as técnicas de cultura de órgãos são particularmente úteis para a investigação dos mecanismos biológicos complexos da IVD. Aqui, descrevemos uma abordagem de alto rendimento para a cultura FSUs rato lombar inteiro que fornece uma plataforma ideal para estudar os mecanismos da doença e terapias para o IVD. Além disso, descrevemos several aplicações que utilizam este processo de cultura de órgão para conduzir mais estudos de imagiologia incluindo microCT com contraste e tridimensional de alta resolução de modelagem de elemento finito da IVD.

Introdução

Dor lombar (LBP) é o principal fator para a deficiência global e perda de produtividade no local de trabalho, e os americanos sozinho gastar em excesso de 50 bilhões de dólares em tratamento LBP ^1. Embora prevalente, a etiologia da LBP permanece complexa e multifatorial. No entanto, disco intervertebral (IVD) degeneração está entre os factores de risco mais importantes para a LBP ^2.

O IVD é feito de três microestruturas: a fibrose exterior do anel (FA), o interior do núcleo pulposo (NP), e duas placas extremas cartilaginosos que sanduíche toda a estrutura proximal e distalmente ^3. Com o envelhecimento ea degeneração, os componentes IVD mudar estruturalmente, de composição, e mecanicamente ^4. Estas alterações incluem a perda de proteoglicanos e hidratação da NP, diminuição da altura do disco, e deteriorou competência mecânico ^5. Estas alterações sãomuitas vezes acompanhada de citoquinas que promovem uma resposta inflamatória, bem como de neutrófilos e gânglio da raiz dorsal de intrusão no espaço da articulação culminando numa cascata de eventos que levam à sintomas LBP ^6.

O estudo dos mecanismos de degeneração IVD é um desafio em seres humanos, porque muitas vezes não é possível isolar a causa da degeneração antes da ocorrência de dor lombar. Assim, uma abordagem redutora de simplificar o sistema experimental para baixo para o órgão IVD permite o ajuste fino mecanicista de variáveis causais e examinando os seus efeitos a jusante ^5. O sistema é reduzida para apenas a população celular nativo e matriz extracelular circundante, permitindo assim que a interpretação directa dos efeitos de estulos externos sobre a degeneração IVD. Além disso, o custo mais baixo e escalabilidade de modelos de murino, bem como o grande número de animais geneticamente modificados ^7, para permitir que tele triagem direcionada rápida de mecanismos degenerativas IVD e terapias potenciais. Aqui, descrevemos um sistema de cultura de órgãos de murino em que IVD estabilidade celular e do tecido é mantida ao longo de 21 dias, com foco específico dado de padrões homeostáticos, mecânicas, estruturais e inflamatórias dos IVDs. Usando esse método, podemos monitorar as mudanças funcionais dos IVDs em um modelo de lesão induzida por facada ⁸ de compreender os mecanismos por trás degeneração do disco. Além disso, nós descrevemos várias aplicações deste processo de cultura de órgão para conduzir mais estudos de imagiologia incluindo microCT com contraste e modelação tridimensional de alta resolução da IVD.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Universidade de Washington em Comissão Estudos Animais St. Louis.

1. Os animais

1. Obter duas estirpes de ratinhos: 10 semanas de idade BALB / c (n = 6, Balb-H, BALB / cAnNTac) e 10 semanas os animais velhos do factor nuclear kappa-B-luciferase repórter (NF-κβ-luc) criado numa ratinhos BALB / c de fundo (n = 6, ratinhos BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
2. Antes da dissecção, sacrificar os animais com CO ₂ sobredosagem a uma taxa de fluxo de 2,5-3 L / min durante 5 min, seguido por uma 2 min adicional de tempo de permanência.
3. Desinfectar a região exterior do animal por banhar-lo em um banho de etanol a 70% durante 2 min antes da dissecação.

2. Dissecção

1. Fazer um corte vertical e longitudinal na superfície dorsal do rato usando pequenas tesouras de dissecação para expor a cavidade do corpo.
2. Fazer dois cortes verticais longitudinais de cada lado da espinha dorsal do animal a partir dea primeira vértebra lombar (L1) até às vértebras caudais (C8).
3. Usando um bisturi, uma pinça fina, e tesouras de dissecação finas, retire cuidadosamente a coluna vertebral de L1-C8 da cavidade do corpo do animal.
4. Cuidadosamente remover o excesso de tecidos moles em torno da coluna vertebral, enquanto assegurando a não raspar ou ferir o IVD no lado ventral.
5. Além disso dissecar a coluna vertebral em vértebras-disco-vértebras da coluna vertebral unidades funcionais (FSU) no L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, e discos C7 / C8.
6. Lavar o FSU em solução salina equilibrada de Hank suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina durante 2 min.
7. Aleatoriamente atribuir os FSUs em três grupos: sem cultura e não tratada FSU (fresca), cultivadas mas não tratada FSU (Controlo), e cultivadas e tratadas facada FSU (Stab).
8. Encaixe congelar as amostras frescas FSU com azoto líquido imediatamente após a dissecação, e armazenar em congelador a -20 ° C.

3. Condições cultura de órgão

1. Preparar 500 mL de meio de cultura estéril de 1: 1 de meio Dulbecco modificado por Eagle: Mistura de Nutrientes F12 (DMEM: F12) suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Usando 10 mL pipetas serológicas, pipeta de 2 ml de meio de cultura em cada cavidade de uma placa de cultura de 24 poços.
3. A seguir a dissecção e enxaguar, colocar cada FSU em uma cavidade individual na placa de 24 poços cheios com meios de comunicação.
4. Incubar as amostras numa incubadora esterilizada que mantém a 37 ° C, 5% de _CO2, 20% _{de O2} e> 90% de humidade.
5. Após um período de cultura inicial de 24 h, mecanicamente ferir as amostras Stab grupo por punção de agulha do anel fibroso usando uma agulha estéril de calibre 27, como mostrado na Figura 1A.
6. Mudar meios a cada 48 h através da preparação de uma nova placa de cultura de 24 poços cheios com meios de comunicação e de transferência de amostras da placa de idade para os novos usando pinças estéreis. Aspirar a velha mídia e dispose da placa de cultura de idade em um caixote do lixo de risco biológico.
7. No último dia da cultura, todas as amostras incubar em meios contendo 0,75 mg / mL de cloreto de nitro azul de tetrazólio durante 24 h.
8. Em seguida, congelar todo o FSU com azoto líquido e armazenar em congelador de -20 ° C até estar pronto para o teste mecânico ou histologia (Figura 1B).

4. As medições longitudinais NF-kB

1. Imagem a FSU a partir de animais-NF-κβ luciferase a 1, 5, 13, e 19 dias para avaliar a expressão de NF-kB.
2. Adicionar 10 uL de solução a 1 mg luciferina / mL a cada poço e incubar numa incubadora estéril a 37 ° C durante 10 min.
3. Imagem as amostras para a bioluminescência, utilizando o sistema de imagem com um tempo de exposição de 1 min e configuração do compartimento de dois.
4. Ao mesmo tempo, usar a máquina para tirar uma fotografia e cobri-la com a imagem de bioluminescência para determinar a localização anatômica de luminescência no IVD.

5. Avaliação mecânica

1. Determinar o comportamento mecânico das IVDs usando compressão dinâmica controlada pelo deslocamento ^9.
2. Usando um microscópio dissecção, escalpelo e pinças, remover os corpos vertebrais ósseas do FSU a partir de cada amostra, mantendo as placas terminais cartilaginosas intacto e ligado ao IVD.
3. Anexar as IVDs isolados para uma placa de alumínio de 1 cm x 1 cm x 0,2 centímetros utilizando cola de cianoacrilato.
4. Medir a altura do disco e largura, tendo uma média de três medições no eixo longitudinal de cada disco, utilizando um micrómetro de laser. Calcular a proporção da altura do disco dividindo a altura média do disco pela largura máxima do disco.
5. Utilizar a altura do disco medido para calcular os valores de tensão de entrada utilizados em testes mecânicos. Note-se que a altura média do disco foi de aproximadamente 690 ± 39? M? M.
6. Coloque as amostras em um banho de solução salina tamponada com fosfato sob a compressina máquina e pré-carregar o disco a 0,02 N.
7. Ciclicamente comprimir o disco, utilizando uma forma de onda sinusoidal a 1 Hz durante 20 ciclos ao nível de tensão de 1% e nível de tensão de 5% para cada 3 ensaios e gravar os valores de carga e de deslocamento da IVD. Permitir 10 minutos de descanso tempo entre ensaios para o disco para relaxar e para evitar ferimentos.
8. Calcular a rigidez média a partir da fase de carga do último ciclo, e calcular a perda tangente do ângulo de fase entre os dados de carga e deslocação.

6. proteoglicanos e colágeno Quantificação

1. Seguindo o teste mecânico, medir o peso húmido do disco colocando o IVD isolado em um tubo de centrífuga previamente tarado e medindo o peso, utilizando uma balança analítica.
2. Digerir os IVDs isolado em 250 ul solução de digestão de papaína (0,1 M acetato de sódio, 0,01 M de EDTA, 0,005 M de cisteína HCl, pH 6,4) durante a noite a 65 ° C utilizando um aquecedor de bloco.
3. Centrifugar as amostras durante 10 mina 2000 xg e recolher o fluido sobrenadante.
4. Medir o teor de proteoglicano da IVD utilizando o ensaio de azul de dimetilmetileno (DMMB) com padrões de sulfato de condroitina.
5. Preparar a soluo de DMMB (21 mg DMMB, 5 mL de etanol absoluto, 2 g de formiato de sódio em 1 L de ddH ₂ O).
6. Pipetar 30 ul dos padrões e amostras, em triplicado, numa placa de 96 pos, juntamente com 250 mL de solução de DMMB em cada poço.
7. Leia a absorvância da placa a 525 nm utilizando um espectrofotómetro.
8. Medir o teor de colagénio usando um kit de ensaio de hidroxiprolina de acordo com as instruções do fabricante.

7. Histologia

1. Fixar um subconjunto das amostras em 4% de paraformaldeído durante 24 h, de-calcificar em ácido fórmico a 5% durante 48 h, desidratar com etanol, e incorporar-se em parafina.
2. Utilizando um micrótomo, as amostras de secção sagital em 10 de espessura e aplicar secções de lâminas de vidro. Manchar as seções usando safranina-O / Fast Green e DAPI.
3. Usando um microscópio de luz, imagem desliza em aumento de 10x.

8. Contraste-enhanced microComputed Tomografia (microCT)

1. Digitalizar um subconjunto de amostras nos pontos de tempo 0, 2, 5, e 7 dias usando longitudinal Ioversol realce ^10, e de ácido fosfomolíbdico (PMA) realce terminal no ponto de tempo de 7 dias.
2. 4 horas antes da microCT tempo de varredura, adicionam-se 300 uL de 350 mg / mL de solução de iodo Ioversol para o meio de cultura para uma concentração final de aproximadamente 50 mg de solução Ioversol / mL contendo iodo e incubar numa incubadora estéril a 37 ° C durante quatro h.
3. Após a incubação, a amostra embrulhar em gaze estéril e colocar num tubo de microcentrífuga de 1 mL.
4. Colocar as amostras no sistema microCT e digitalizar em 45 keVp, 177 mA, 10,5 tamanho mm voxel, e 300 ms integração.
5. Exportar dados do microCT como arquivos DICOM e visualizar usando software ( por exemplo, OsiriX).
6. No ponto de tempo de 7 dias, corrigir amostras usando uma solução de paraformaldeído a 4% durante 24 h, seguido por solução a 5% de PMA durante 3 dias, e digitalizar utilizando as mesmas definições como as utilizadas na etapa 8.4.

9. Tridimensional Modelação Elementos Finitos

1. Segmento os arquivos DICOM dos IVDs usando software com limiarização manual (por exemplo, OsiriX).
2. Converter os volumes NP e AF do IVD em malhas de elementos finitos baseada em voxel usando MeshLab.
3. Combine as microestruturas da NP e AF para formar um IVD completa e aplicar condições de contorno determinadas experimentalmente no software de elementos finitos.

Resultados

As Figuras 2-3 mostram resultados representativos de distribuição de proteoglicano, a expressão de NF-kB, a rigidez, a viscosidade, a altura do disco, e peso molhado para IVDs cultivadas de ratinho. Se cultivadas adequadamente, os parâmetros IVD do grupo de controlo não deve ser significativamente diferente do grupo de fresco. Se a cultura está infectado ou de outro modo comprometida, o grupo de controlo irá ser diferente do grupo de fresco, especialmente na expressão de NF-kB e de distribuiçã...

Discussão

Este protocolo descreve uma cultura de órgão do FSU murino com ênfase sobre o controlo das alterações biológicas no IVD. A manutenção bem-sucedida dessas culturas requer técnicas estéreis cuidadosos. Em particular, a dissecção passos 2,1-2,6 e a cultura passos 3,1-3,6 requerem um cuidado especial para garantir condições estéreis são mantidas, e estes passos deverá ser realizada preferencialmente numa sala de procedimentos isolado com um fluxo de ar HEPA para minimizar co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	Midwest Scientific	TP92096	Used for biochemical assays
24 well plate	Midwest Scientific	TP92024	Used for organ culture
25 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94024	Used for organ culture
10 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94010	Used for organ culture
5 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94005	Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm	Midwest Scientific	TP99505	Used for filter media
10 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140098	Used for biochemical assays
200 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140900	Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140920	Used for biochemical assays
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032	Used for culture media
Optiray 350	Guebert	19133341	Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442	Used for culture media
Penicillin Streptomycin	Sigma	P4333	Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride	Sigma	T4375	Used for biochemical assays
D-Luciferin	Sigma	L6152	Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate	Sigma	C9819	Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution	Sigma	HT152	Used for contrast enhanced microCT
Safranin O	Sigma	S8884	diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF	Sigma	F7258	.001% concentration
Papain from papaya latex	Sigma	P3125	Used for biochemical assays
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue	Loctite	234790	Adhesive
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fischer Scientific	S348903	Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent	ActiveLife		For mechanical testing
Cytation 5	Biotek		Spectrophotometer
AxioCam503	Carl Zeiss AG		Microscope
VivaCT40	Scanco		MicroCT
Analytical balance	Denver Instrument Company	A-200DS	Analytical balance
Incubator HERAcell 150i	Thermo Scientific		Organ Culture
Dissection Scope	VistaVision		Used during dissection
Laser Micrometer	Keyence	LK-081	Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R	Eppendorf		Used for biochemical assays
Microtome	Leica	RM2255	Used for histology
Software
Prism 7	GraphPad		For statistics
MATLAB R2014a	Mathworks		For modeling
Osiri-LXIV	Pixmeo		Open Source
MeshLab v1.3.3	Visual Computing Lab - ISTI - CNR		Open Source
PreView/FEBio 2.3	Utah MRL & Columbia MBL		Open Source
ImageJ	NIH
Microsoft Excel	Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02	Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)	Fine Science Tools	14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)	Fine Science Tools	14060-11
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-40	At least 2; can also use #3
Extra Fine Graefe Forceps, serrated	Fine Science Tools	11150-10	At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated	World Precision Instruments	503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth	World Precision Instruments	501244
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel Blades - #23	Fine Science Tools	10023-00
Insect Pins, size 000	Fine Science Tools	26000-25
27 G Needle	BD PrecisionGlide Needles	BD305109