<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

요약

척추 디스크 (IVD)의 전체 기관 배양 물은 세포 외 기질 원시 세포 표현형, 및 세포 - 기질 상호 작용을 보존한다. 여기에서 우리는 마우스 요추 및 기능적 척추 단위 꼬리, 사후 관리 및이 시스템을 이용한 여러 응용 프로그램을 사용하여 체외 배양 시스템을 설명합니다.

초록

척추 디스크 (IVD)의 변성은 요통에 크게 기여. IVD는 전송 및 척추에 부하를 저해하는 역할을하는 섬유 연골 관절이다. IVD는 프로테오글리칸 풍부한 수핵 (NP) 및 연골 단부 플레이트에 의해 협지 된 콜라겐이 풍부한 고리 섬유증 (AF)로 구성된다. 서로 인접 척추와 척추-IVD 구조는 기능 척추 유닛 (FSU)을 형성한다. 이 미세 고유 세포 유형뿐만 아니라 고유의 세포 외 매트릭스를 포함한다. 구소련의 전체 기관 문화는 원시 세포 외 기질, 세포 분화 표현형 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 따라서, 기관 배양 기술은 IVD의 복잡한 생물학적 메커니즘을 조사하는 데 특히 유용하다. 여기, 우리는 IVD에 대한 질병 메커니즘과 치료법을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다 전체 요추 마우스 Fsus를 배양을위한 높은 처리량 방법을 설명합니다. 또한, 우리는의를 설명조영 증강 microCT 이미징 및 IVD 입체 고해상도 유한 요소 모델링을 포함하여 추가 연구를 수행이 장기 배양 방법을 이용하는 애플리케이션 everal.

서문

요통 (LBP)는 직장에서의 글로벌 장애에 대한 주요 요인 및 생산성 손실, 그리고 미국인들은 혼자 LBP 치료 ^한 50 억 달러의 초과 지출. 유행이지만, LBP의 원인은 복잡하고 다원적 남아있다. 그러나 척추 디스크 (IVD)의 변성은 LBP ^2의 가장 중요한 위험 인자 중 하나입니다.

IVD 세 마이크로 제조된다 : 외부 환형 섬유증 (AF), 내부 수핵 (NP), 및 근위부와 원위부 ⁽³⁾ 전체의 구조를 끼우는 두 연골 종판. 노화와 퇴행으로, IVD 구성 요소는 구성 적, 구조적 변화, 기계적 ^4. 이러한 변화가 NP의 프로테오글리칸 및 수분의 손실을 포함하는, 디스크 높이의 감소, 및 기계적 ^능력을 저하 ^5. 이러한 변화는종종 LBP 현상 ⁶ 이어질 사건 캐스케이드 절정 공동 공간으로 염증 반응뿐만 아니라, 호중구 및 후근 신경절 침입을 촉진 사이토킨 수반.

이 요통의 발생 전에 변성의 원인을 분리하는 것이 불가능하기 때문 IVD 변성의 메커니즘을 공부하는 것은 인간의 도전이다. 따라서, IVD 기관에 이르기까지 실험 시스템을 단순화의 환원 주의적 접근 방식은 인과 변수의 기계적 미세 조정을 할 수 있으며 자신의 다운 스트림 효과 ⁽⁵⁾ 검사. 이 시스템은 따라서 IVD 퇴화에 외부 자극 효과의 직접적인 해석을 가능하게 만 원시 세포 집단 및 세포 외 기질을 둘러싸는 감소된다. 또한, 낮은 비용과 생쥐 모델의 확장 성뿐만 아니라, 유전자 변형 동물 ^(7)의 많은 수의, t 허용IVD 퇴행성 메커니즘과 잠재적 치료의 그는 빠른 대상으로 심사. 여기서는 IVD 세포 및 조직 안정성, 사후 관리가 '항상성 기계적 구조, 및 염증성 패턴 주어진 특정 포커스 21 일 이상 유지되는 뮤린 기관 배양 시스템을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 디스크의 변성 뒤에 메커니즘을 이해하는 자상에 의한 손상 모델 ^(8)에서, 사후 관리 '기능의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 더욱이, 우리는 조영 증강 microCT 이미징 및 IVD 입체 고해상도 모델링 포함한 추가 연구를 수행하는 기관이 배양 방법의 여러 애플리케이션을 설명한다.

프로토콜

모든 동물 실험은 세인트 루이스 동물 연구위원회의 워싱턴 대학을 준수 하였다.

1. 동물

1. (N = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) 및 10 주령 핵 인자 카파 B - 루시퍼 라제 리포터 동물들 (NF-κβ 뤽)는에 자란 10 주령의 BALB / C : 마우스의 두 가지 변종을 구하는 BALB / C 배경 (N = 6, BALB / C-(TG RELA 뤽) 31Xen).
2. 해부하기 전에, 시간 거주지의 추가 2 분,이어서 5 분 동안 2.5-3 L / min의 유량으로 CO ₂ 과량으로 동물을 안락사.
3. 박리 전에 2 분 동안 70 % 에탄올 욕에서 입욕하여 동물의 외측 영역 소독.

2. 해부

1. 체강 노출되도록 절개 작은 가위를 사용하여 마우스의 등쪽 표면에 길이 방향의 수직 절단을 확인.
2. 부터 동물의 척추의 양쪽에 두 개의 길이 방향의 수직 절단을 확인제 요추 척추 꼬리로 (L1) (C8).
3. 메스 미세 겸자 미세 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 동물의 체강 내에서 L1-C8의 척추를 제거한다.
4. 긁어 또는 복부 측 IVD을 손상하지 않도록 보장하면서 조심스럽게 척추 주변 초과 연조직을 제거한다.
5. 또한, L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 및 C7 / C8 디스크에서 척추 디스크 - 척추 기능 척추 유닛 (Fsus를)로 척추 해부.
6. 1 % 2 분 동안 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 행크 평형 염 용액에 Fsus를 씻어.
7. 교양 및 치료 Fsus를 (신선한), 배양 그러나 치료 Fsus를 (제어), 배양 및 찔린 처리 Fsus를 (스탭) : 무작위로 세 그룹으로 Fsus를 할당합니다.
8. 스냅 즉시 -20 ° C의 냉동고에서 해부하고 저장 한 후 액체 질소로 신선한 FSU 샘플을 동결.

3. 장기 문화 조건

1. 멸균 배지 500㎖의 준비 1 : 둘 베코 변형 이글 배지 : 영양 혼합물 F12 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 (DMEM F12).
2. 24 웰 배양 플레이트의 각 웰에 10 ㎖의 혈청 피펫, 피펫 배양액 2 ㎖의 사용.
3. 절개를 따라 린스 미디어 채워진 24 웰 플레이트의 개별 웰에 서로 FSU를 배치했다.
4. 37 ° C, 5 % CO _2, 20 % O ₂ 및> 90 %의 습도를 유지하고 멸균 배양기에서 샘플을 인큐베이션.
5. 24 시간의 초기 배양 기간 후, 기계적으로도 1a에 도시 된 바와 같이 무균 27 게이지 바늘을 사용하여 섬유륜의 바늘 구멍을 통해 스터브 군 샘플 손상.
6. 새로운 사용 무균 핀셋 오래 플레이트로부터 새로운 미디어 채워진 24 웰 배양 플레이트를 준비하여 미디어마다 48 시간을 변경하고, 이전 샘플. 기존의 미디어와 dispos을 대기음생물 학적 폐기물 빈의 옛 문화 판의 전자.
7. 배양의 마지막 날에, 24 시간 동안 0.75 ㎎ / ㎖ 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드를 함유하는 배지에서 모든 샘플을 배양한다.
8. 그 후, 동결 모든 Fsus를 기계적 시험 또는 조직학 (도 1b)에 대한 준비를 할 때까지 -20 ℃ 냉동고에서 액체 질소와 함께 점포.

4. 경도 측정 NF-κB

1. 이미지는 1에서 NF-κβ - 루시 페라 동물 Fsus를, 5, 13, 19 일 NF-κB의 발현을 평가합니다.
2. 10 분 동안 37 ℃에서 멸균 배양기에서 각각 1 ㎎ / ㎖의 루시페린 용액 10 μL를 첨가하고 잘 배양한다.
3. 이미지 1 분의 노출 시간 및 (2)의 빈 설정으로 촬상 시스템을 이용하여 생물 발광 용 샘플.
4. 동시에, 사진을 가지고와 IVD에 발광의 해부학 적 위치를 결정하기 위해 생물 발광 이미지와 오버레이 기계를 사용합니다.

5. 기계 평가

1. 변위 제어 동적 압축 ^9를 사용하여, 사후 관리의 기계적 거동을 결정한다.
2. 손상 및 IVD에 부착 된 연골 종판 유지하면서 해부 현미경 메스와 핀셋을 사용하여, 각 시료에서의 FSU 뼈 추체를 제거한다.
3. 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 이용하여 1cm X 1cm X 0.2 cm의 알루미늄 판으로 격리, 사후 관리를 첨부.
4. 레이저 마이크로 미터를 이용하여 각 디스크의 세로축에 3 개 회 측정의 평균을 취함으로써, 디스크의 높이 및 폭을 측정한다. 디스크의 최대 폭의 평균 디스크 높이를 나눈 디스크 높이 비율을 계산한다.
5. 기계적 시험에 사용되는 입력 스트레인 값을 계산하기 위해 측정 된 디스크 키를 사용한다. 디스크의 평균 높이는 약 690 ㎛의 ± 39 ㎛, 참고.
6. compressi 하에서 인산 완충 식염수 용기에 샘플을 놓고기계 0.02 N.에 디스크를 미리로드
7. 순환 시험 3 20 1 %의 변형 수준 및 사이클 5 % 스트레인 레벨 1 Hz에서 각각 정현파를 사용하여 디스크를 압축 및 IVD의 하중과 변위 값을 기록한다. 긴장과 손상을 방지하기 위해 시험 디스크 사이의 휴식 시간이 10 분을 허용한다.
8. 최종 사이클의 로딩 단계로부터의 평균 강도를 계산하고, 변위 및 하중 데이터 사이의 위상 각의 정접을 계산한다.

6. 프로테오글리칸 및 콜라겐 정량화

1. 기계적 시험에 따라, 미리 칭량 한 원심 관에 분리 배치 IVD 및 분석 저울을 사용하여 중량을 측정함으로써 디스크 습윤 중량을 측정한다.
2. 250 μL의 파파인 소화 용액을 분리, 사후 관리 다이제스트 (0.1 M 아세트산 나트륨, 0.01 M EDTA, 0.005 M 염산 시스테인, pH를 6.4) 블록 히터를 사용하여 밤새 65 ° C에서.
3. 10 분 동안 원심 분리 샘플2,000 XG의 상청액을 수집하고.
4. 콘드로이틴 설페이트 표준과 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB) 분석을 사용하여 IVD의 프로테오글리칸 함량을 측정.
5. DMMB 용액 (21 mg을 DMMB 5 mL의 무수 에탄올 1 L DDH ₂ O 2 g을 포름산 나트륨)을 준비한다.
6. 각 웰에 피펫 DMMB 용액 250 μL와 함께 96 웰 플레이트에서 30 중으로 표준 μL 샘플.
7. 분광 광도계를 사용하여 525 nm에서 플레이트의 흡광도를 읽는다.
8. 제조업체의 지침에 따라 히드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 콜라겐 함량을 측정한다.

7. 조직학

1. 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 샘플들의 서브 세트를 수정을 48 시간 동안 5 % 포름산 탈 석회 성으로 만들다, 에탄올로 탈수시키고, 파라핀에 삽입.
2. sagittally 10 개 μm의 두께 부, 샘플을 마이크로톰을 사용하여 유리 슬라이드에 적용 섹션. Safranin-O / 빨리 할머니를 사용하여 섹션을 얼룩EEN 및 DAPI.
3. 광학 현미경을 사용하여, 이미지는 10 배 배율로 슬라이드.

제 조영 증강 microComputed 단층 촬영 (microCT)

1. 7 일의 시점에서 길이 Ioversol의 콘트라스트 향상 ¹⁰ 단자 인 몰리브덴 산 (PMA), 콘트라스트 강조를 사용하여 0, 2, 5, 7 일 시점에서의 샘플의 일부를 스캐닝.
2. microCT 스캔 시간에 앞서 4 시간, 4, 37 ° C에서 멸균 배양기에서 350 밀리그램 / 약 50 ㎎ / ㎖ 요오드 함유 Ioversol 용액의 최종 농도를위한 배양 배지에 ㎖의 요오드 Ioversol 용액 300 μL를 추가 부화 시간.
3. 인큐베이션 후, 1 ㎖의 마이크로 원심 튜브에의 멸균 거즈 장소에서 샘플 랩.
4. microCT 시스템 플레이스 샘플 45 keVp 177 μA, 10.5 μm의 복셀 사이즈, MS (300)에 통합 검색.
5. 수출 DICOM 파일로 microCT 데이터와 소프트웨어를 사용하여 시각화 ( 예를 들어, OsiriX).
6. 7 일 시점에서 3 일 동안 5 % PMA 용액을이어서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 사용하여 샘플을 고정하고, 단계 8.4에서 사용 된 것과 동일한 설정을 사용하여 검사한다.

제 3 차원 유한 요소 모델링

1. 세그먼트 수동 임계 값 (예를 들어, OsiriX)와 소프트웨어를 사용하여, 사후 관리의 DICOM 파일.
2. Meshlab를 사용하여 복셀 기반 유한 요소 메쉬로 IVD의 NP 및 AF 볼륨 변환.
3. 완전한 IVD를 형성하고 유한 요소 소프트웨어에서 실험적으로 결정 경계 조건을 적용 NP와 AF의 미세 구조를 결합합니다.

결과

도 2-3 배양 마우스, 사후 관리를위한 분배 프로테오글리칸, NF-κB의 발현 강도, 점도, 디스크 키, 습윤 중량의 대표적인 결과를 나타낸다. 제대로 배양하면, 제어 그룹의 IVD 매개 변수는 신선한 그룹에서 유의 한 차이를해서는 안됩니다. 문화가 손상 달리 감염 또는 경우, 대조군 특히 NF-κB의 발현과 프로테오글리칸 유통의 신선한 그룹에서 다른 것입니다 (결과는 도시하지 않음). IVD의 ...

토론

이 프로토콜은 IVD의 생물학적 변화를 모니터링에 중점을두고 쥐의 FSU의 장기 문화를 설명합니다. 이러한 문화의 성공적인 유지 보수주의 멸균 기술을 필요로한다. 특히, 박리는 2.1-2.6 단계 배양은 3.1-3.6 무균 상태가 유지되도록하기 위해 특별한주의를 필요로 단계,이 단계는 오염을 최소화하는 HEPA 공기 흐름과 격리 절차 방에서 바람직하게 수행되어야한다. 절개 과정 조...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	Midwest Scientific	TP92096	Used for biochemical assays
24 well plate	Midwest Scientific	TP92024	Used for organ culture
25 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94024	Used for organ culture
10 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94010	Used for organ culture
5 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94005	Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm	Midwest Scientific	TP99505	Used for filter media
10 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140098	Used for biochemical assays
200 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140900	Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140920	Used for biochemical assays
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032	Used for culture media
Optiray 350	Guebert	19133341	Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442	Used for culture media
Penicillin Streptomycin	Sigma	P4333	Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride	Sigma	T4375	Used for biochemical assays
D-Luciferin	Sigma	L6152	Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate	Sigma	C9819	Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution	Sigma	HT152	Used for contrast enhanced microCT
Safranin O	Sigma	S8884	diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF	Sigma	F7258	.001% concentration
Papain from papaya latex	Sigma	P3125	Used for biochemical assays
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue	Loctite	234790	Adhesive
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fischer Scientific	S348903	Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent	ActiveLife		For mechanical testing
Cytation 5	Biotek		Spectrophotometer
AxioCam503	Carl Zeiss AG		Microscope
VivaCT40	Scanco		MicroCT
Analytical balance	Denver Instrument Company	A-200DS	Analytical balance
Incubator HERAcell 150i	Thermo Scientific		Organ Culture
Dissection Scope	VistaVision		Used during dissection
Laser Micrometer	Keyence	LK-081	Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R	Eppendorf		Used for biochemical assays
Microtome	Leica	RM2255	Used for histology
Software
Prism 7	GraphPad		For statistics
MATLAB R2014a	Mathworks		For modeling
Osiri-LXIV	Pixmeo		Open Source
MeshLab v1.3.3	Visual Computing Lab - ISTI - CNR		Open Source
PreView/FEBio 2.3	Utah MRL & Columbia MBL		Open Source
ImageJ	NIH
Microsoft Excel	Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02	Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)	Fine Science Tools	14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)	Fine Science Tools	14060-11
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-40	At least 2; can also use #3
Extra Fine Graefe Forceps, serrated	Fine Science Tools	11150-10	At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated	World Precision Instruments	503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth	World Precision Instruments	501244
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel Blades - #23	Fine Science Tools	10023-00
Insect Pins, size 000	Fine Science Tools	26000-25
27 G Needle	BD PrecisionGlide Needles	BD305109