Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Zusammenfassung

Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen.

Zusammenfassung

Bandscheibe (IVD) Degeneration ist ein wichtiger Faktor für Schmerzen im unteren Rücken. Der IVD ist ein fibrocartilagineum Gelenk, das in der Wirbelsäule Lasten zu übertragen und dämpfen dient. Der IVD besteht aus einem Proteoglycan reichen Nukleus pulposus (NP) und einem kollagenreichen Anulus fibrosus (AF) von knorpeligen Endplatten sandwichartig angeordnet. Zusammen mit den benachbarten Wirbeln, bildet die Wirbel-IVD-Struktur mit einer funktionellen Wirbelsäuleneinheit (FSU). Diese Mikrostrukturen enthalten einzigartige Zelltypen sowie einzigartige extrazellulären Matrix. Ganz Organkultur der FSU bewahrt die native extrazellulären Matrix, Zelldifferenzierung Phänotypen und zelluläre-Matrix-Interaktionen. Somit sind Organkultur-Techniken besonders nützlich für die komplexen biologischen Mechanismen des IVD zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen High-Throughput-Ansatz zur Kultivierung gesamte Lendenwirbel Maus FSU, die für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Therapien für die IVD eine ideale Plattform zur Verfügung stellt. Darüber hinaus beschreiben wir siele Anwendungen, die diese Organkulturverfahren nutzen weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Finite-Elemente-Modellierung des IVD zu leiten.

Einleitung

Schmerzen im unteren Rücken (LBP) ist der führende Faktor für die globale Behinderung und verlorene Produktivität am Arbeitsplatz, und die Amerikaner allein verbringen mehr als 50 Milliarden Dollar für LBP Behandlung ^1. Obwohl weit verbreitet, bleibt die Ätiologie von LBP komplex und multifaktoriell. Allerdings ist Bandscheibe (IVD) Degeneration zu den bedeutendsten Risikofaktoren für LBP ^2.

Der IVD ist aus drei Mikrostrukturen: die äußere Anulus fibrosus (AF), der Innenraum Nucleus pulposus (NP) und zwei knorpeligen Endplatten, die die gesamte Struktur proximal und distal ³ - Sandwich. Mit dem Altern und Degeneration, ändern sich die Komponenten IVD Strukturell kompositionell und mechanisch ^4. Diese Änderungen umfassen den Verlust von Proteoglykanen und Feuchtigkeit in der NP, verringerte Scheibenhöhe und verschlechterte mechanische Kompetenz ^5. Diese Veränderungen sindoft durch Cytokine begleitet , die eine Entzündungsreaktion, sowie Neutrophilen und Spinalganglien Eindringen in den Gelenkraum kulminiert in einer Kaskade von Ereignissen zu fördern , die ⁶ bis LBP Symptomen führen.

Die Untersuchung der Mechanismen der IVD-Degeneration ist eine Herausforderung beim Menschen, weil es oft nicht möglich ist, die Ursache für die Degeneration vor dem Auftreten von Schmerzen im unteren Rücken zu isolieren. Somit wurde ein reduktionistischen Ansatz , um das experimentelle System zu vereinfachen , bis auf die IVD Organ ermöglicht mechanistische Feinabstimmung der kausalen Variablen und Prüfung ihre nachgelagerten Effekte ^5. Das System wird nur die nativen Zellpopulation reduziert und extrazelluläre Matrix umgibt, wodurch die direkte Interpretation der Auswirkungen von äußeren Reizen auf IVD-Degeneration zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen die niedriger Kosten und die Skalierbarkeit von murinen Modellen, sowie die große Anzahl von gentechnisch veränderten Tieren ^7, für ter rasch gezielte Screening von IVD degenerative Mechanismen und mögliche Therapien. Hier beschreiben wir ein Maus-Organkultursystem, in der IVD Zell- und Gewebestabilität über 21 Tage gehalten wird, mit besonderem Schwerpunkt auf den IVDs gegeben homeostatic, mechanische, strukturelle und entzündliche Muster. Mit dieser Methode überwachen wir die funktionellen Veränderungen IVDs in einem Stich induziertes Verletzungsmodell ⁸ , die Mechanismen hinter Scheibendegeneration zu verstehen. Weiterhin beschreiben wir mehrere Anwendungen dieser Organkulturverfahren weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Modellierung des IVD zu leiten.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Washington University in St. Louis Tierstudien Ausschuss durchgeführt.

1. Tiere

1. Erhalten Sie zwei Stämme von Mäusen: 10 Wochen alte Balb / c (n = 6, Balb-M, BALB / cAnNTac) und 10 Wochen alte nuclear factor kappa-B-Luciferase-Reporter Tiere (NF-κβ-luc) gezüchtet auf einem BALB / c-Hintergrund (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen).
2. Vor der Dissektion euthanize Tiere mit CO ₂ Überdosierung bei einer Flußrate von 2,5-3 l / min für 5 min , gefolgt von weiteren 2 min Zeit der Behausung.
3. Desinfizieren des Außenbereiches des Tieres, indem sie in einem 70% Ethanol-Bad für 2 min vor der Dissektion Baden.

2. Dissection

1. Führte einen Längsvertikalschnitt auf der dorsalen Oberfläche der Maus kleine Dissektion Schere mit der Körperhöhle zu exponieren.
2. Machen Sie zwei vertikale Längsschnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule des Tieres abder erste Lendenwirbel (L1) an die Schwanzwirbel (C8).
3. Unter Verwendung eines Skalpells, feinen Pinzette und Schere fein Dissektion vorsichtig entfernen die Wirbelsäule von L1-C8 aus der Körperhöhle des Tiers.
4. vorsichtig entfernen überschüssige Weichgewebe die Wirbelsäule umgeben, während sichergestellt wird, um nicht abkratzen oder IVD auf der ventralen Seite verletzen.
5. die Wirbelsäule in die Wirbelkörper-scheiben Wirbel funktionelle Wirbelsäuleneinheiten (FSU) in der L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 und C7 / C8 Scheiben weiter sezieren.
6. Spülen Sie die FSU in Hanks balancierter Salzlösung, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin für 2 min.
7. zuweisen zufalls die FSU in drei Gruppen: uncultured und unbehandeltem FSUs (frisch), gezüchteten aber unbehandelten FSUs (Kontrolle) kultiviert und behandelt FSUs stab (STAB).
8. Schnellfrost die frischen FSU Proben mit flüssigem Stickstoff unmittelbar nach Dissektion und Speicher in einem -20 ° C-Gefrierschrank.

3. Organkulturbedingungen

1. Bereiten 500 ml steriles Kulturmedium von 1: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin.
2. Unter Verwendung von 10 ml serologischen Pipetten, Pipetten 2 ml Kulturmediums in jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen.
3. Folgende Dissektion und spülen, stellen jeweils FSU in eine einzelne Vertiefung in den Medien gefüllten 24-Well-Platte.
4. Inkubieren der Proben in einem sterilen Inkubator, 37 ° C, 5% CO _2, 20% O ₂ und> 90% Luftfeuchtigkeit bewahrt.
5. Nach einer anfänglichen Kulturdauer von 24 h, verletzen mechanisch STAB Gruppenproben über Nadeleinstich des Anulus fibrosus eine sterile 27-Gauge - Nadel , wie in 1A gezeigt.
6. Ändern Medien alle 48 h durch eine neue Medien gefüllte Vorbereitung 24-Well-Kulturplatte und Transfer Proben von der alten Platte auf die neue mit einem sterilen Pinzette. Aspirieren die alten Medien und dispose der alten Kulturplatte in einem Biohazard Abfalleimer.
7. Am letzten Tag der Kultur, Inkubieren alle Proben in Medium 0,75 mg / ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid für 24 h enthalten.
8. Danach gefriert ganzen FSUs mit flüssigem Stickstoff und Speicher in einem -20 ° C - Gefrierschrank , bis sie bereit für die mechanische Prüfung oder Histologie (1B).

4. Längs Messungen NF-kappaB

1. Bild die FSU von NF-κβ-Luciferase Tieren bei 1, 5, 13 und 19 Tagen NF-kappaB Ausdruck zu bewerten.
2. Zugabe von 10 & mgr; l von 1 mg / ml Luciferin-Lösung in jeder Vertiefung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 10 min.
3. Bild, um die Proben für die Biolumineszenz unter Verwendung des Abbildungssystems mit einer 1 min Belichtungszeit und bin Einstellung von 2.
4. Gleichzeitig verwendet die Maschine um ein Bild aufzunehmen und es mit dem Biolumineszenz-Bild überlagert die anatomische Lage der Lumineszenz in der IVD zu bestimmen.

5. mechanische Beurteilung

1. Bestimme das mechanische Verhalten der IVDs durch Verwendung Wegkontrolliert dynamische Kompression ^9.
2. Unter Verwendung einen Dissektionsmikroskop, Skalpell und Pinzette, entfernt die knöchernen Wirbelkörper der FSU von jeder Probe, während der knorpeligen Endplatten intakt zu halten und den IVD befestigt.
3. Befestigen der isolierten IVDs auf eine 1 cm x 1 cm x 0,2 cm Aluminiumplatte unter Verwendung von Cyanacrylat-Klebstoff.
4. Messen Sie die Scheibenhöhe und Breite um durchschnittlich drei Messungen auf der Längsachse jeder Scheibe unter einem Laser-Mikrometer verwendet wird. Berechnen Sie das Scheibenhöhenverhältnis, indem die durchschnittliche Scheibenhöhe durch die maximale Scheibenbreite dividiert wird.
5. Verwenden der gemessenen Scheibenhöhe der Eingangsspannungswerte in mechanischen Tests verwendet zu berechnen. Beachten Sie, dass die durchschnittliche Scheibenhöhe um ± 39 um etwa 690 war.
6. Platzieren Sie die Proben in einer phosphatgepufferten Salzbades unter der compressiauf Maschine und Vorspannung der Scheibe bis 0,02 N.
7. Zyklisch komprimiert die Scheibe mit einer sinusförmigen Wellenform bei 1 Hz für 20 Zyklen bei der 1% Dehnung Ebene und 5% Dehnungsniveau für jede 3-Studien unter Verwendung von und die Last und die Verschiebungswerten der IVD aufzuzuzeichnen. Erlauben Sie 10 Minuten Zeit zwischen den Versuchen für die Scheibe ruht sich zu entspannen und um Verletzungen zu vermeiden.
8. Berechne die mittlere Steifigkeit von der Ladephase des letzten Zyklus, und berechnet die Verlusttangente von dem Phasenwinkel zwischen Last- und Verschiebungsdaten.

6. Proteoglycan und Kollagen Quantifizierung

1. Nach der mechanischen Tests messen die Scheibe Naßgewicht durch das isolierte IVD in einer vorher tariertes Zentrifugenröhrchen platziert und Messen des Gewichts einer Analysenwaage verwendet wird.
2. Verdauen des isolierten IVDs in 250 & mgr; l Papain-Digestion-Lösung (0,1 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M Cystein-HCl, pH 6,4) über Nacht bei 65 ° C ein Heizblock verwendet wird.
3. Zentrifuge Proben für 10 minbei 2000 × g und die überstehende Flüssigkeit sammeln.
4. Messen Sie das Proteoglycan-Gehalt des IVD durch die Dimethylmethylen blaue Verwendung (DMMB) -Assay mit Chondroitinsulfat-Standards.
5. Bereiten DMMB - Lösung (21 mg DMMB, 5 ml absolutes Ethanol, 2 g Natriumformiat in 1 l ddH ₂ O).
6. Pipette 30 ul Standards und Proben in dreifacher Ausführung in einer 96-Well-Platte, zusammen mit 250 ul DMMB-Lösung in jeder Vertiefung.
7. Die Absorption der Platte bei 525 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers.
8. Messen Sie den Kollagengehalt eines Hydroxyprolin-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.

7. Histologie

1. Fix eine Teilmenge der Proben in 4% Paraformaldehyd für 24 h, de-verkalken für 48 h in 5% Ameisensäure, Entwässern mit Ethanol und in Paraffin eingebettet werden.
2. Unter Verwendung eines Mikrotoms, Abschnitt werden die Proben sagittal bei 10 & mgr; m Dicke und gelten Schnitte an den Glasobjektträger. Beflecken die Abschnitte mit Safranin-O / Fast Green und DAPI.
3. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, Bild gleitet bei 10facher Vergrößerung.

8. Contrast-enhanced microComputed Tomography (microCT)

1. Scannen eine Teilmenge von Proben , die bei den 0, 2, 5 und 7-Tage - Zeitpunkt unter Verwendung von Ioversol Längskontrastverstärkung ¹⁰ und dem Anschluss Phosphomolybdänsäure (PMA) Kontrastverstärkung bei dem 7 - tägigen Zeitpunkt.
2. 4 h vor dem microCT Abtastzeit, fügt 300 ul 350 mg / ml Jod Ioversol-Lösung zu den Kulturmedien für eine Endkonzentration von etwa 50 mg / mL iodhaltigen Ioversol-Lösung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 4 h.
3. Nach der Inkubation wickelt die Probe in steriler Gaze und in einem Mikrozentrifugenröhrchen 1 ml.
4. Die Proben werden in dem System microCT und Scan bei 45 keVp, 177 & mgr; A, 10,5 um Voxel-Größe, und 300 ms Integration.
5. Exportieren von Daten aus dem microCT als DICOM-Dateien und visualisieren Software ( zB OsiriX).
6. An dem 7-Tage-Zeitpunkt, zu beheben Proben mit einer 4% Paraformaldehydlösung für 24 Stunden unter Verwendung von, gefolgt von 5% PMA-Lösung für 3 Tage, und scannen Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 8.4 verwendet werden.

9. Dreidimensional Finite-Elemente-Modellierung

1. Segment der DICOM - Dateien des IVD unter Verwendung von Software mit manuellem Thresholding (zB OsiriX).
2. Konvertieren Sie die NP und AF Volumina des IVD in Voxel-basierten Finite-Elemente-Netze mit Meshlab.
3. Kombinieren Sie die Mikrostrukturen des NP und AF eine komplette IVD zu bilden und gilt experimentell bestimmte Randbedingungen in der Finite-Elemente-Software.

Ergebnisse

Figuren 2-3 zeigen repräsentative Ergebnisse von Proteoglycan Verteilung, NF & kgr; B Expression, Steifigkeit, Viskosität, Scheibenhöhe und Naßgewicht für kultivierte Maus IVDs. Wenn sie richtig kultiviert, werden die IVD Parameter der Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden von der Frische-Gruppe. Wenn die Kultur infiziert ist oder auf andere Weise beeinträchtigt, wird die Kontrollgruppe aus der Frischen Gruppe unterschiedlich sein, vor allem in NF-kappaB-Expression und Proteoglykan Vert...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Organkultur des murinen FSU mit dem Schwerpunkt auf die biologischen Veränderungen in der IVD-Überwachung. Die erfolgreiche Aufrechterhaltung dieser Kulturen erfordert eine sorgfältige sterile Techniken. Insbesondere werden die Schritte der Präparation 2,1-2,6 und die Kultur Schritte 3,1-3,6 besondere Sorgfalt erfordern sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, werden beibehalten, und diese Schritte sollten vorzugsweise in einem isolierten Behandlungs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	Midwest Scientific	TP92096	Used for biochemical assays
24 well plate	Midwest Scientific	TP92024	Used for organ culture
25 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94024	Used for organ culture
10 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94010	Used for organ culture
5 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94005	Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm	Midwest Scientific	TP99505	Used for filter media
10 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140098	Used for biochemical assays
200 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140900	Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140920	Used for biochemical assays
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032	Used for culture media
Optiray 350	Guebert	19133341	Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442	Used for culture media
Penicillin Streptomycin	Sigma	P4333	Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride	Sigma	T4375	Used for biochemical assays
D-Luciferin	Sigma	L6152	Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate	Sigma	C9819	Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution	Sigma	HT152	Used for contrast enhanced microCT
Safranin O	Sigma	S8884	diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF	Sigma	F7258	.001% concentration
Papain from papaya latex	Sigma	P3125	Used for biochemical assays
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue	Loctite	234790	Adhesive
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fischer Scientific	S348903	Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent	ActiveLife		For mechanical testing
Cytation 5	Biotek		Spectrophotometer
AxioCam503	Carl Zeiss AG		Microscope
VivaCT40	Scanco		MicroCT
Analytical balance	Denver Instrument Company	A-200DS	Analytical balance
Incubator HERAcell 150i	Thermo Scientific		Organ Culture
Dissection Scope	VistaVision		Used during dissection
Laser Micrometer	Keyence	LK-081	Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R	Eppendorf		Used for biochemical assays
Microtome	Leica	RM2255	Used for histology
Software
Prism 7	GraphPad		For statistics
MATLAB R2014a	Mathworks		For modeling
Osiri-LXIV	Pixmeo		Open Source
MeshLab v1.3.3	Visual Computing Lab - ISTI - CNR		Open Source
PreView/FEBio 2.3	Utah MRL & Columbia MBL		Open Source
ImageJ	NIH
Microsoft Excel	Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02	Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)	Fine Science Tools	14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)	Fine Science Tools	14060-11
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-40	At least 2; can also use #3
Extra Fine Graefe Forceps, serrated	Fine Science Tools	11150-10	At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated	World Precision Instruments	503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth	World Precision Instruments	501244
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel Blades - #23	Fine Science Tools	10023-00
Insect Pins, size 000	Fine Science Tools	26000-25
27 G Needle	BD PrecisionGlide Needles	BD305109