bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Özet

intervertebral disk (IVD) Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Burada fare bel ve bunların fonksiyonel spinal birimlerinde kaudal IVD'ler ve bu sistemi kullanan birçok uygulamaları kullanarak bir IVD kültür sistemi açıklanmaktadır.

Özet

İntervertebral disk (IVD) dejenerasyonu, bel ağrısı için önemli bir katkıda bulunmaktadır. IVD iletmek ve omurgasında yükleri azaltacak hizmet veren bir fibrokartilajinöz eklemdir. IVD proteoglikandan zengin nucleus (NP) ve kıkırdak uç plakaları arasında kalan bir kolajen zengin halka fibroz (AF) oluşur. Birlikte komşu vertebralar ile omurlar-IVD yapısı fonksiyonel omurga birimi (ESB) oluşturmaktadır. Bu mikro benzersiz hücre türleri yanı sıra özgün hücre dışı matrisler içerir. FSU Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre farklılaşması fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Bu nedenle, organ kültürü teknikleri IVD karmaşık biyolojik mekanizmaları araştırmak için yararlıdır. Burada, İVG hastalık mekanizmalarını ve terapileri eğitimi için ideal bir platform sağlar bütün bel fare FSUs yetiştirmek için kullanılan bir yüksek verimli bir yaklaşım açıklar. Ayrıca, s tarifkontrastlı microCT görüntüleme ve IVD üç boyutlu yüksek çözünürlüklü sonlu elemanlar modelleme dahil başka çalışmalar yapmak için bu organ kültürü yöntemi kullanan everal uygulamalar.

Giriş

Bel ağrısı (BA) işyerinde küresel sakatlık için önde gelen faktör ve kayıp verimlilik ve Amerikalılar yalnız LBP tedavisi ¹ 50 milyar doların üzerinde harcama. yaygın olmakla birlikte, bel ağrısı etiyolojisi kompleks ve çok kalır. Bununla birlikte, intervertebral disk (IVD) dejenerasyon LBP ² için en önemli risk faktörleri arasında yer almaktadır.

IVD üç mikroyapıların meydana gelir: dış halka fibroz (AF), iç çekirdeği pulposus (NP) ve proksimal ve distal olarak ³ bütün yapı sandviç iki kıkırdak omurun. Yaşlanma ve dejenerasyon ile IVD bileşenleri kompozisyonel yapısal değişiklik ve mekanik ^4. Bu değişiklikler, NP proteoglikanlar ve hidrasyon kaybı gibi, disk yüksekliği azalması ve mekanik yetkinlik ⁵ bozulmuştur. Bu değişiklikler şunlardırgenellikle LBP semptomları ⁶ yol edilen bir olay grubuyla sonuçlanan eklem yeri boşluğuna bir enflamatuvar yanıtı ve aynı zamanda nötrofil ve dorsal kök ganglion girmesini teşvik sitokinler ile birlikte.

bel ağrısı verilmeden önceki dejenerasyon nedenini ortadan kaldırmak için çoğu zaman mümkün değildir, çünkü IVD dejenerasyon mekanizmalarının incelenmesi insanlarda zordur. Bu nedenle, IVD organa aşağı deneysel sistem basitleştirilmesi indirgemeci yaklaşım nedensel değişkenlerin mekanik ince ayarlanmasına izin verir ve bunların bir aşağı akış etkisine ⁵ incelenmesi. Sistem böylece IVD dejenerasyonu dış uyaranların etkileri doğrudan yorumlanmasını sağlar, ancak doğal hücre nüfusu ve hücre-dışı matrisi çevreleyen, indirgenir. Ayrıca, daha az maliyet ve fare modellerinin ölçeklenebilirlik, aynı zamanda, genetik olarak tadil edilmiş hayvanlar ⁷ çok sayıda, t izinIVD dejeneratif mekanizmalarla ve potansiyel terapilerin o hızla hedefe yönelik tarama. Burada, IVD hücre ve doku stabilitesi IVD'ler, homeostatik mekanik, yapısal ve inflamatuar desen verilen belirli bir odak ile, 21 gün boyunca muhafaza edildiği bir murin organ kültürü sistemi tarif eder. Bu yöntemi kullanarak, disk dejenerasyonu altında yatan mekanizmaları anlamak için bir bıçak kaynaklı yaralanma modelinde ⁸ IVD'ler fonksiyonel değişiklikleri izler. Ayrıca, kontrastlı microCT görüntüleme ve IVD üç boyutlu yüksek çözünürlüklü modelleme dahil başka çalışmalar yapmak için bu organ kültürü yönteminin çeşitli uygulamaları açıklar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Louis Hayvan Araştırmaları Komitesi Washington Üniversitesi ile uyumlu olarak gerçekleştirildi.

1. Hayvanlar

1. (N = 6, BALB-E, BALB / cAnNTac) ve 10 haftalık nükleer faktör kappa-B-lusiferaz raportör hayvanları (NF-κβ-luc) bir yetiştirilen 10 haftalık BABL / c farelerinin iki soy elde edilir BALB / c arka plan (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen).
2. Diseksiyon önce, zaman yaşayan ek bir 2 dakika, ardından 5 dakika boyunca 2.5-3 L / dk'lık bir akış hızında _CO2, aşırı dozda hayvanların euthanize.
3. Diseksiyon önce 2 dakika süreyle% 70 etanol banyosu içinde banyo ile hayvanın dış bölge dezenfekte.

2. Diseksiyon

1. Vücut boşluğuna maruz küçük diseksiyon makas kullanılarak fare dorsal yüzeyi üzerinde bir uzunlamasına dikey kesim yapın.
2. başlayarak hayvanın omurganın her iki tarafında iki boyuna dikey kesimler yapınİlk omurga kaudal vertebra (L1) (C8).
3. neşter, ince forseps ve ince diseksiyon makas kullanarak dikkatli bir şekilde hayvanın vücut boşluğundan L1-C8 omurgaya çıkarın.
4. kazımak veya ventral tarafında IVD zarar değil sağlarken dikkatlice, omurga çevreleyen, yumuşak dokuları çıkarın.
5. Bundan başka, L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 ve C7 / C8 disklerinde vertebra-disk omurlar fonksiyonel omurga birimi (FSUs) içine omurga incelemek.
6. % 1 2 dakika boyunca penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Hank dengeli tuz çözeltisi içinde FSUs durulayın.
7. kültürlenmemiş ve işlenmemiş FSUs (Taze), kültürlenmiş ama tedavi edilmemiş FSUs (Kontrol) ve kültüre edildiği ve levha tedavi FSUs (Stab): rasgele üç gruba FSUs atar.
8. Ek bileşen hemen -20 ° C dondurucu içinde diseksiyon ve depo edilmesinden sonra sıvı azot ile taze ESB örnekleri dondurma.

3. Organ Kültür Koşulları

1. steril kültür ortamı 500 mL Hazırlama 1: 1 Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı: Nutrient Mixture F12:% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş (DMEM F12).
2. 24 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 10 ml serolojik pipetler, pipet kültür ortamı 2 ml kullanılması.
3. diseksiyon sonra ve durulama, ortam ile doldurulmuş, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir birey haline her FSU yerleştirin.
4. 37 ° C,% 5 _CO2,% 20 _O2 ve>% 90 nem muhafaza eden bir steril bir inkübatörde inkübe edin.
5. 24 saatlik bir başlangıç kültür döneminden sonra, mekanik olarak, Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, steril bir 27 gauge iğne ile annulus fibrosus iğne delinmesi ile delinmeye grubu örnekleri zarar.
6. Yeni kullanılarak steril cımbız eski plakadan yeni bir ortam ile doldurulmuş 24 oyuklu bir kültür plakası hazırlanarak Ortam 48 saatte bir değiştirme ve aktarım örnekleri. Eski medya ve dispos aspireBir biyolojik tehlike atık kutusuna eski kültür plakasının e.
7. kültürün son gününde, 24 saat süre ile 0.75 mg / ml nitro mavi tetrazolyum klorür ihtiva eden ortam içinde tüm örnekleri inkübe edin.
8. Daha sonra, dondurarak tüm FSUs mekanik test veya histoloji (Şekil 1B) için hazır olana kadar -20 ° C dondurucu içinde sıvı azot ve mağaza ile.

4. Uzunlamasına Ölçümler NF-KB

1. Görüntü 1 de NF-κβ-lusiferaz hayvanlardan FSUs, 5, 13 ve 19 gün NF-KB ifadesini değerlendirmek için.
2. 10 dakika boyunca 37 ° C'de steril inkübatörde her 1 mg / ml lusiferin çözeltisinin 10 uL de ekleyin ve inkübe edilir.
3. Görüntü bir 1 dk maruziyet süresi ve 2 bin ayarıyla görüntüleme sistemi kullanılarak biyolüminesans için örnekler.
4. Eşzamanlı olarak, bir fotoğrafını çekip IVD içinde lüminesans anatomik yerini belirlemek için biyolüminesans görüntüsü ile bindirmek için makineyi kullanın.

5. Mekanik Değerlendirme

1. Deplasman kontrollü dinamik sıkıştırma ⁹ kullanarak IVD'ler mekanik davranışını belirler.
2. sağlam ve IVD'nin bağlı kıkırdak uç plaka tutarken bir diseksiyon mikroskobu, neşter, ve cımbız kullanarak, her bir numuneden, eski Sovyetler kemik omur gövdelerinin çıkarın.
3. siyanoakrilat yapıştırıcı ile, bir 1 cm x 1 cm x 0,2 cm alüminyum levhaya izole IVD'ler takın.
4. bir lazer mikrometre kullanılarak her diskin uzunlamasına ekseni üzerinde üç ölçümün ortalaması alınarak disk yüksekliğini ve genişliğini ölçün. maksimum disk genişliği ortalama disk yüksekliğine bölerek disk yükseklik oranını hesaplar.
5. mekanik test kullanılan girdi gerilme değerlerini hesaplamak için ölçülen disk yüksekliğini kullanın. Ortalama diski yüksekliği yaklaşık 690 um ± 39 um olduğu not edin.
6. compressi altında, bir fosfat tamponlu tuzlu su içinde numunelerMakinede 0.02 N'ye disk önceden yüklenmesi
7. Siklik 3 denemeleri için 20 1% tür düzeyinde döngüleri ve% 5 suşu seviyesi için 1 Hz, her bir sinüs dalga formu kullanılarak disk sıkıştırmak ve IVD'nin Yük ve yer değiştirme değerlerini kaydedin. dinlenmek ve yaralanmaları önlemek için disk için çalışmalar arasındaki dinlenme zaman 10 dakika bekleyin.
8. Son çevrimin yükleme fazı ortalama sertlik hesaplayın ve Yük ve yer değiştirme verileri arasındaki faz açısı kayıp tanjantı hesaplar.

6. Proteoglikan ve Kolajen Niceleme

1. mekanik test sonra, bir ön-darası alınmış santrifüj tüpüne izole IVD yerleştirilmesi ve bir analitik terazi kullanılarak ağırlığının ölçülmesi disk ıslak ağırlık ölçer.
2. 250 uL papain sindirim çözeltisi izole IVD'ler Digest (0,1 M sodyum asetat, 0.01 M EDTA, 0.005 M sistein HCI, pH 6.4) bir blok ısıtıcı kullanılarak bir gece boyunca 65 ° C'de karıştırıldı.
3. 10 dakika süre ile santrifüj örnekleri2.000 x g'de yüzeydeki sıvı toplamak ve.
4. kondroitin sülfat standartlarına dimetilmetilen mavisi (DMMB) analizi kullanılarak IVD proteoglikan içeriği ölçülür.
5. DMMB çözeltisi (21 mg, DMMB, 5 ml mutlak etanol, 1 L GKD ₂ O 2 g sodyum format) hazırlayın.
6. Pipet her yuva içinde, DMMB çözeltisi 250 uL ile birlikte 96 oyuklu bir plaka içerisinde, üç kopya halinde 30 standartları uL ve örnekler.
7. Bir spektrofotometre kullanılarak 525 nm'de plakanın emilmesini okuyun.
8. Üretici talimatlarına uygun olarak bir hidroksiprolin tahlili kiti kullanılarak kolajen içeriği ölçün.

7. Histoloji

1. , 24 saat süresince% 4 paraformaldehit içinde numunelerinin bir alt saptamak 48 saat,% 5 formik asit içinde de-kalsifiye, etanol ile kurutmak, ve parafin içine yerleştirin.
2. sajital 10 um kalınlığında bölüm, numune bir mikrotom kullanılarak ve cam slaytlara bölümleri uygulanır. Safranin-O / Hızlı Gr kullanılarak bölümleri Lekeeen ve DAPI.
3. Bir ışık mikroskobu kullanılarak, görüntü 10X büyütmede kayar.

8. Kontrastlı microComputed Tomografi (mikroBT)

1. 7 günlük bir zaman noktasında boylamasına iyoversol kontrastlı ¹⁰ ve terminal fosfomolibdik asit (PMA) kontrast iyileştirme sistemi kullanılarak, 0, 2, 5 ve 7 günlük zaman noktalarında numuneler bir alt tarama.
2. mikroBT tarama süresi öncesinde 4 saat, 4, 37 ° C'de steril bir inkübatörde 350 mg / yaklaşık 50 mg / mL iyot içeren iyoversol solüsyonunun, nihai konsantrasyonu için kültür ortamına ml iyodin iyoversol çözeltisi 300 uL ekleyebilir ve inkübe h.
3. İnkübasyondan sonra, 1 mL mikrosantrifüj tüpü içinde, steril bir gazlı bez ve yerine örnek sarın.
4. mikroBT sisteminde yer örnekler ve 45 keVp, 177 uA, 10.5 um voksel boyutu, 300 ms, entegrasyon tarama.
5. İhracat DICOM dosyaları olarak mikroBT gelen veriler ve yazılımlar kullanılarak görselleştirmek ( örneğin OsiriX).
6. 7 günlük bir zaman noktasında, 3 gün süre ile% 5 PMA çözeltisi, ardından 24 saat boyunca bir% 4 paraformaldehid çözeltisi kullanılarak örnekleri saptamak ve adım 8.4 kullanılanlar ile aynı ayarları kullanarak tarama.

9. Üç Boyutlu Sonlu Eleman Model

1. Segment manuel eşikleme (örneğin OsiriX) ile yazılımı kullanarak IVD'ler DICOM dosyaları.
2. Meshlab kullanarak voksel tabanlı sonlu elemanlar kafes içine IVD NP ve AF hacimleri dönüştürün.
3. Tam bir IVD oluşturacak ve sonlu elemanlar yazılımında deneysel olarak belirlenen sınır koşulları kullanılarak NP ve AF mikro yapılarını birleştirin.

Sonuçlar

Şekiller 2-3 kültürlenmiş fare IVD'ler için proteoglikan dağılımı, NF-KB ekspresyonu, sertlik, viskozite, disk yüksekliği ve yaş ağırlık temsili sonuçlar göstermektedir. Düzgün kültürlendirilmiş, Denetim grubunun IVD parametreleri Taze grubundan önemli ölçüde farklı olmamalıdır. Kültür tehlikeye aksi enfekte edilmiş veya ise, kontrol grubu, özellikle NF-KB ekspresyonu ve proteoglikan dağıtımında, taze grubundan farklı olacaktır (sonuçlar gösterilmemiştir). I...

Tartışmalar

Bu protokol IVD biyolojik değişikliklerin izlenmesi üzerinde durularak fare FSU bir organdır kültürünü özetliyor. Bu kültürlerin başarılı bakım dikkatli steril teknikler gerektirir. Özellikle, diseksiyon 2.1-2.6 adımları ve Kültür 3.1-3.6'da steril koşulların korunmasını sağlamak için özel dikkat gerektirir adım, ve bu aşamalar kirleticiler en aza indirmek için bir HEPA hava akışı ile izole edilmiş bir uygulama odasında tercihen yapılmalıdır. Dis...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	Midwest Scientific	TP92096	Used for biochemical assays
24 well plate	Midwest Scientific	TP92024	Used for organ culture
25 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94024	Used for organ culture
10 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94010	Used for organ culture
5 mL pipettes	Midwest Scientific	TP94005	Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm	Midwest Scientific	TP99505	Used for filter media
10 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140098	Used for biochemical assays
200 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140900	Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips	Midwest Scientific	NP89140920	Used for biochemical assays
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032	Used for culture media
Optiray 350	Guebert	19133341	Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442	Used for culture media
Penicillin Streptomycin	Sigma	P4333	Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride	Sigma	T4375	Used for biochemical assays
D-Luciferin	Sigma	L6152	Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate	Sigma	C9819	Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution	Sigma	HT152	Used for contrast enhanced microCT
Safranin O	Sigma	S8884	diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF	Sigma	F7258	.001% concentration
Papain from papaya latex	Sigma	P3125	Used for biochemical assays
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue	Loctite	234790	Adhesive
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fischer Scientific	S348903	Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent	ActiveLife		For mechanical testing
Cytation 5	Biotek		Spectrophotometer
AxioCam503	Carl Zeiss AG		Microscope
VivaCT40	Scanco		MicroCT
Analytical balance	Denver Instrument Company	A-200DS	Analytical balance
Incubator HERAcell 150i	Thermo Scientific		Organ Culture
Dissection Scope	VistaVision		Used during dissection
Laser Micrometer	Keyence	LK-081	Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R	Eppendorf		Used for biochemical assays
Microtome	Leica	RM2255	Used for histology
Software
Prism 7	GraphPad		For statistics
MATLAB R2014a	Mathworks		For modeling
Osiri-LXIV	Pixmeo		Open Source
MeshLab v1.3.3	Visual Computing Lab - ISTI - CNR		Open Source
PreView/FEBio 2.3	Utah MRL & Columbia MBL		Open Source
ImageJ	NIH
Microsoft Excel	Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02	Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)	Fine Science Tools	14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)	Fine Science Tools	14060-11
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-40	At least 2; can also use #3
Extra Fine Graefe Forceps, serrated	Fine Science Tools	11150-10	At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated	World Precision Instruments	503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth	World Precision Instruments	501244
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel Blades - #23	Fine Science Tools	10023-00
Insect Pins, size 000	Fine Science Tools	26000-25
27 G Needle	BD PrecisionGlide Needles	BD305109