JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Всего органной культура межпозвонкового диска (МПД) сохраняет нативный внеклеточный матрикс, клеточные фенотипы и клеточно-матрица. Здесь мы опишем систему IVD культуры с использованием поясничных мышей и хвостовые IVDs в их функциональных спинальных узлах и несколько приложений, использующих эту систему.

Аннотация

Межпозвоночный диск (IVD) дегенерация является существенным фактором низкой боли в спине. IVD является соединение, которое относящийся к волокнистой хрящевой ткани служит для передачи и смочить нагрузок в позвоночнике. IVD состоит из протеогликанов богатых студенистого ядра (НП) и богатый коллаген пульпозного (AF), зажатого с помощью хрящевых концевых панелей. Вместе со смежными позвонками, структура позвонков-IVD образует функциональный блок позвоночника (БСС). Эти микроструктур содержат уникальные типы клеток, а также уникальные внеклеточный матрикс. Всего органной культура БССА сохраняет нативный внеклеточный матрикс, дифференциации клеток фенотипов и клеточно-матрица. Таким образом, методы органной культуры являются особенно полезными для исследования сложных биологических механизмов IVD. Здесь мы описываем с высокой пропускной подход для культивирования весь поясничный пох мыши, которая обеспечивает идеальную платформу для изучения механизмов болезни и терапии для IVD. Кроме того, мы опишем Several приложения, которые используют этот метод органной культуры для проведения дальнейших исследований, включая контрастированием microCT визуализации и трехмерного высокого разрешения моделирования конечных элементов в IVD.

Введение

Боль в пояснице (LBP) является ведущим фактором глобальной инвалидности и потери производительности на рабочем месте, и только американцы тратят свыше 50 миллиардов долларов на лечении LBP 1. Хотя распространены, этиология LBP остается сложной и многофакторной. Тем не менее, межпозвоночного диска (IVD) дегенерация является одним из наиболее значимых факторов риска для LBP 2.

IVD состоит из трех микроструктур: внешняя кольцевая фиброз (АФ), внутренние студенистое ядра (НП), и два хрящевых концевых шайб , что сэндвич - вся структура проксимально и дистально 3. Со старением и дегенерацией, компоненты IVD изменить структурно, композиционно, и механически 4. Эти изменения включают в себя потерю протеогликанов и гидратации в НП, уменьшение высоты диска, а также ухудшение механической компетентности 5. Эти изменения являютсячасто сопровождаются цитокин , которые способствуют воспалительную реакцию, а также нейтрофилы и заднекорешкового вторжение ганглия в суставное пространство , кульминации в каскаде событий , которые приводят к появлению симптомов LBP 6.

Изучение механизмов дегенерации МПД является сложной задачей для человека, потому что это часто не представляется возможным, чтобы изолировать причину дегенерации до появления боли в пояснице. Таким образом, редукционистом подход упрощает экспериментальную систему вплоть до IVD органа позволяет механистической тонкую настройку причинных переменных и изучение их вниз по течению 5. Система сводится только к родной популяции клеток и окружающих внеклеточного матрикса, что позволяет прямую интерпретацию воздействия внешних раздражителей на IVD дегенерации. Кроме того, более низкая стоимость и масштабируемость мышиных моделях, а также большое количество генетически модифицированных животных 7, позволяют тон быстрый целевой скрининг дегенеративных механизмов IVD и потенциальных методов лечения. Здесь мы описываем мышиную систему органной культуры, в которой IVD клеточная и тканевая стабильность сохраняется в течение 21 дней, с особым вниманием к данному гомеостазу, механическим, структурным и воспалительным СТРУКТУРАМ IVDs. Используя этот метод, мы контролируем функциональные изменения , которые IVDs' в колотой модели индуцированной травмы 8 , чтобы понять механизмы , лежащие дегенерациями диска. Кроме того, мы опишем несколько применений этого способа культивирования органа для проведения дальнейших исследований, включая контрастированием microCT визуализации и трехмерного моделирования с высокой разрешающей способностью в IVD.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Вашингтонского университета в Комитете по изучению животных Сент-Луисе.

1. Животные

  1. Получают два штамма мышей: 10-недельного возраста линии BALB / с (п = 6, BALB-М, BALB / cAnNTac) и 10-недельных ядерного фактора каппа-В-люциферазы репортер животных (NF-κβ-Luc) разводят на BALB / с фоном (п = 6, BALB / с-Тг (Рела-Luc) 31Xen).
  2. До вскрытия, эвтаназии животных с СО 2 передозировки при скорости потока 2,5-3 л / мин в течение 5 мин с последующей дополнительной 2 мин времени задержки.
  3. Дезинфекция вне области животного, промывая его в ванне этанола 70% в течение 2 мин до вскрытия.

2. Препарирование

  1. Делают продольный вертикальный разрез на дорсальной поверхности мыши с помощью небольших рассечение ножницами, чтобы обнажить полость тела.
  2. Сделайте две продольные вертикальные разрезы по обе стороны от позвоночника животного, начиная спервый поясничных позвонков (L1), в хвостовых позвонков (С8).
  3. Используя скальпель, пинцет, мелкие и тонкие рассечение ножницами, осторожно удалить позвоночник от L1-C8 из полости тела животного.
  4. Осторожно удалите избыток мягких тканей, окружающих позвоночник, обеспечивая при этом, чтобы не царапать или повреждать IVD на брюшной стороне.
  5. Далее рассекают позвоночник в позвонках-диска позвонков функциональных спинальных единиц (пох) на L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, С3 / С4 / С5, С6, С7 и / С8 дисков.
  6. Ополосните пох в сбалансированном солевом растворе Хэнка с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина в течение 2 мин.
  7. Случайным назначить пох на три группы: некультурных и необработанной ПОХ (свежие), культивируют, но необработанной ПОХ (контроль), и культивировали и обрабатывали колотой ПОХ (Stab).
  8. Привязка заморозить образцы Свежий БСС с жидким азотом сразу после вскрытия и хранить в морозильной камере C -20 °.

3. Орган Условия культивирования

  1. Подготовьте 500 мл стерильной культуральной среды 1: 1 Дульбекко модифицированная среда Игла: питательная смесь F12 (DMEM: F12) с добавлением 20% бычьей эмбриональной сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина.
  2. Используя 10 мл серологические пипетки, пипетки 2 мл культуральной среды в каждую лунку планшета для культуры 24-луночного.
  3. После вскрытия и промыть, поместить каждую БСС в отдельную лунку в средствах массовой информации заполнены 24-луночного планшета.
  4. Инкубируйте образцы в стерильном инкубаторе , который поддерживает 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 и> влажности 90%.
  5. После начального периода культивирования 24 ч, механически травмировать образцы Стаб групп с помощью прокола фиброзного кольца , используя стерильный 27 калибра иглы , как показано на рисунке 1А.
  6. Изменение среды каждые 48 ч по подготовке нового медиа-заполнены 24-луночный культуральный планшет, и образцы передачи от старой пластины к новым использованием стерильных пинцетов. Аспирируйте старые средства массовой информации и Disposе старой культуры пластины в бункере для биологически опасных отходов.
  7. В последний день культивирования, инкубировать все образцы в среде, содержащей 0,75 мг / мл хлорида нитро синего тетразолия в течение 24 ч.
  8. После этого, заморозить все ПОХ с жидким азотом и хранить в морозильной камере C -20 ° до готовности для механических испытаний или гистологии (Фиг.1В).

4. Продольные измерения NF-кВ

  1. Изображение по ПОХ от NF-Кв-люциферазы животных на 1, 5, 13 и 19 дней, чтобы оценить экспрессию NF-kB.
  2. Добавьте 10 мкл раствора 1 мг / мл люциферин в каждую лунку и инкубируют в стерильном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
  3. Изображение образцов для биолюминесценции с использованием системы формирования изображения с 1 мин времени экспозиции и настройкой бен 2.
  4. Одновременно с этим, использовать машину, чтобы сфотографировать и обложите его биолюминесценцию изображения, чтобы определить анатомическое расположение люминесценции в IVD.
5. Механическая оценка

  1. Определить механическое поведение IVDs с помощью перемещения контролируемого динамического сжатия 9.
  2. С помощью микроскопа рассечения, скальпель и пинцет, удалить костные тела позвонков бывшего СССР из каждого образца при сохранении хрящевых концевых шайб целости и прилагаются к IVD.
  3. Приложить изолированный IVDs к алюминиевой пластине в 1 см х 1 см х 0,2 см с использованием цианакрилатный клея.
  4. Измерьте высоту и ширину диска, принимая в среднем трех измерений на продольной оси каждого диска с помощью лазерного микрометра. Рассчитывает соотношение высоты диска путем деления средней высоты диска по максимальной ширине диска.
  5. С помощью измеренной высоты диска для вычисления значений деформации входных используемых в механических испытаниях. Обратите внимание, что средняя высота диска составляла приблизительно 690 мкм ± 39 мкм.
  6. Поместите образцы в фосфатно-солевом буферном ванну под compressiна машине и предварительной загрузки диска до 0,02 N.
  7. Циклический сжать диск с помощью синусоидального сигнала с частотой 1 Гц в течение 20 циклов на уровне деформации 1% и 5% уровня деформации в течение 3 испытаний каждый и записывать значение нагрузки и смещения IVD. Подождите 10 мин времени отдыха между испытаниями для диска, чтобы расслабиться и избежать травм.
  8. Рассчитывают среднюю жесткость от фазы загрузки последнего цикла, и вычислить тангенс потерь от фазового угла между данными нагрузки и перемещения.

6. протеогликан и Коллаген Количественный

  1. После механических испытаний, измерение влажного веса диска путем помещения изолированного IVD в предварительно взвешенной центрифужной пробирке и измерение веса с помощью аналитических весов.
  2. Дайджест выделенных IVDs в 250 мкл раствора папаин пищеварения (0,1 М ацетата натрия, 0,01 М ЭДТА, 0,005 М цистеина HCl, рН 6,4) в течение ночи при 65 ° С с использованием блока нагревателя.
  3. Центрифуга образцы в течение 10 минпри 2000 мкг и собирают надосадочную жидкость.
  4. Измерьте протеогликан содержания IVD с помощью диметилметилена синего (DMMB) анализа со стандартами хондроитинсульфата.
  5. Готовят раствор DMMB (21 мг DMMB, 5 мл абсолютного этанола, 2 г формиата натрия в 1 л DDH 2 O).
  6. Пипетка 30 мкл стандартов и образцов в трех экземплярах в 96-луночный планшет, вместе с 250 мкл раствора DMMB в каждую лунку.
  7. Измерить оптическую плотность пластины при 525 нм с использованием спектрофотометра.
  8. Измерьте содержание коллагена с использованием набора для анализа гидроксипролины в соответствии с инструкциями производителя.

7. гистологии

  1. Закрепить подмножество образцов в 4% параформальдегидом в течение 24 ч, де-отвердевают в 5% -ной муравьиной кислоты в течение 48 ч, обезвоживают с этанолом, и встроить в парафин.
  2. Используя микротом, раздел образцов сагиттального при толщине 10 мкм и применяется к секции стеклам. Пятно секции, используя Safranin-O / Fast Grееп и DAPI.
  3. С помощью светового микроскопа, изображение скользит на 10-кратным увеличением.

8. Контрастное microComputed томография (microCT)

  1. Сканирование подмножества выборок в моменты времени 0, 2, 5 и 7 дней с использованием продольного Ioversol контрастом усиления 10, и концевое фосфорно кислоты (ПМА) контрастированием усиления в момент времени 7 дней.
  2. 4 ч до microCT времени сканирования, добавить 300 мкл 350 мг / мл иода Ioversol раствора в культуральной среде до конечной концентрации приблизительно 50 мг / мл йода раствора, содержащего Ioversol и инкубировать в стерильном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 4 час
  3. После инкубации обернуть образец в стерильной марли и место в микроцентрифужных трубки 1 мл.
  4. Место образцы в системе microCT и сканировать при 45 keVp, 177 мкА, размер мкм вокселей 10,5, и 300 мс интеграции.
  5. Экспорт данных из microCT как DICOM файлов и визуализации с помощью программного обеспечения ( например, OsiriX).
  6. В момент времени 7 дней, исправить образцы с использованием 4% -ного раствора параформальдегида в течение 24 ч, а затем 5% -ным раствором PMA в течение 3 дней, и сканирование с использованием тех же параметров, как те, которые используются на этапе 8.4.

9. Трехмерное моделирование методом конечных элементов

  1. Сегмент в DICOM файлы в IVDs с использованием программного обеспечения с ручным пороговым (например, OsiriX).
  2. Преобразование томов NP и AF на IVD в вокселях на основе конечных элементов с использованием сетки MeshLab.
  3. Объединяют микроструктуры НП и AF, чтобы сформировать полный IVD и применить экспериментально определенные граничные условия в программном обеспечении конечных элементов.

Результаты

Фигуры 2-3 показывают репрезентативные результаты протеогликанов распределения, выражение NF-kB, жесткость, вязкость, высоту диска, и мокрый вес для культивируемого IVDs мыши. Если культивировать правильно, параметры IVD из контрольной группы не должны существенно отличаться от Фр?...

Обсуждение

Этот протокол очерчивает органную культуру мышиного БССА с акцентом на мониторинг биологических изменений в IVD. Успешное содержание этих культур требует тщательной стерильной техники. В частности, рассечение шаги 2,1-2,6 и культура шаги 3,1-3,6 требуют особого ухода, чтобы...

Раскрытие информации

Авторы этой рукописи заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Университета Musculoskeletal исследовательского центра в Вашингтоне (NIH P30 AR057235), молекулярной визуализации Центр (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Грант (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 и NIH K01AR069116. Авторы хотели бы поблагодарить Патрик Вонг за его вклад в сбор данных.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well plateMidwest ScientificTP92096Used for biochemical assays
24 well plateMidwest ScientificTP92024Used for organ culture
25 mL pipettesMidwest ScientificTP94024Used for organ culture
10 mL pipettesMidwest ScientificTP94010Used for organ culture
5 mL pipettesMidwest ScientificTP94005Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µmMidwest ScientificTP99505Used for filter media
10 µL pipette tipsMidwest ScientificNP89140098Used for biochemical assays
200 µL pipette tipsMidwest ScientificNP89140900Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tipsMidwest ScientificNP89140920Used for biochemical assays
DMEM/F-12Invitrogen11330032Used for culture media
Optiray 350Guebert19133341Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine SerumSigmaF2442Used for culture media
Penicillin Streptomycin SigmaP4333Used for culture media
Tetrazolium Blue ChlorideSigmaT4375Used for biochemical assays
D-LuciferinSigmaL6152Used for bioluminescence imaging
Chondroitin SulfateSigmaC9819Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid SolutionSigmaHT152Used for contrast enhanced microCT
Safranin OSigmaS8884diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCFSigmaF7258.001% concentration
Papain from papaya latexSigma P3125Used for biochemical assays
DAPISigma-AldrichD9542Nucleic acid staining
Cyanoacrylate GlueLoctite234790Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge TubesFischer ScientificS348903Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDentActiveLifeFor mechanical testing
Cytation 5BiotekSpectrophotometer
AxioCam503Carl Zeiss AGMicroscope
VivaCT40ScancoMicroCT
Analytical balanceDenver Instrument CompanyA-200DSAnalytical balance
Incubator HERAcell 150iThermo ScientificOrgan Culture
Dissection ScopeVistaVisionUsed during dissection
Laser MicrometerKeyenceLK-081Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 REppendorfUsed for biochemical assays
MicrotomeLeica RM2255Used for histology
Software
Prism 7GraphPadFor statistics
MATLAB R2014aMathworksFor modeling
Osiri-LXIVPixmeoOpen Source
MeshLab v1.3.3Visual Computing Lab - ISTI - CNROpen Source
PreView/FEBio 2.3Utah MRL & Columbia MBLOpen Source
ImageJNIH
Microsoft ExcelWindows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools  15000-02Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small)Fine Science Tools  14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger)Fine Science Tools  14060-11
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools  11252-40At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serratedFine Science Tools  11150-10At least 2
Micro-Adson Forceps, serratedWorld Precision Instruments503719-12
Micro-Adson Forceps, teethWorld Precision Instruments501244
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools  10003-12
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools  10004-13
Scalpel Blades - #23Fine Science Tools  10023-00
Insect Pins, size 000Fine Science Tools26000-25
27 G NeedleBD PrecisionGlide NeedlesBD305109

Ссылки

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены