水平凝胶电泳用于增强蛋白质 - RNA复合物的检测

摘要

天然聚丙烯酰胺凝胶电泳是分析RNA蛋白相互作用的基础工具。传统上大多数实验都使用垂直凝胶。然而，水平凝胶提供了几个优点，例如在电泳期间监测复合物的机会。我们提供生成和使用水平天然凝胶电泳的详细协议。

摘要

天然聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学的基础工具，广泛应用于RNA-蛋白质相互作用的生物化学分析。这些相互作用传统上用两片玻璃板和垂直电泳样品之间产生的聚丙烯酰胺凝胶进行分析。然而，聚丙烯酰胺凝胶在托盘中浇铸并水平电泳提供了几个优点。例如，用于分析荧光RNA底物和特定蛋白质之间的复合物的水平凝胶可以在电泳进行时多次成像。这提供了在实验期间在几个点监测RNA-蛋白复合物的独特机会。此外，水平凝胶电泳可以并行分析许多样品。这可以大大促进时间实验以及同时分析多个反应以比较不同的组件和条件。我们这里制定详细的方案，用于生成和使用水平天然凝胶电泳分析RNA-蛋白质相互作用。

引言

电泳迁移率变动分析（EMSAs）已被证明是一种宝贵的生化工具分析特定的蛋白质-核酸相互作用^1，2，3。这些检测可以提供关于蛋白质与RNA或DNA的结合亲和力的重要信息³ ，核酸 - 蛋白质复合物¹的组分化学计量学，并通过底物竞争实验提供关于RNA结合蛋白的结合特异性的重要新见解¹ 。

用于这些测定的传统实验装置包括将纯化的蛋白质与放射性标记的RNA底物混合。然后用不变性（天然的）聚丙烯酰胺凝胶分析所得的复合物，将其倒入两个玻璃板之间，然后在垂直装置^3中进行样品电泳。尽管这种方法已被彻底地用于提供蛋白质与核酸结合的基础的生物化学机制的重要见解，但它也具有一些限制。例如，这种基本策略具有相对低的吞吐量，并且不容易适用于需要并行分析许多结合反应的应用。此外，与传统的立式设备是有挑战性的电泳^3,4期间潜在地监测在多个时间络合物。

这里，我们提出了使用铸造成平板装置天然聚丙烯酰胺凝胶，水平电泳和荧光标记的RNA底物^{4，5，6，7}的EMSA分析的适应。将这些相对简单的修改结合到基本的strategy提供了一些强大的优势。特别地，水平平板格式很容易同时分析几十个样本⁴ 。此外，对于一些RNA-蛋白复合物，例如在Bicaudal-C蛋白和其RNA底物之间形成的那些在水平凝胶中电泳的那些，提供了分辨不同RNA-蛋白复合物的增加的能力，并将它们与未结合的RNA底物区分开来。

研究方案

水平天然聚丙烯酰胺凝胶的制备⁴ 。

1. 准备所需材料
   1. 对于水平凝胶装置，使用具有27cm×21cm托盘的凝胶盒（37cm×24cm），并容纳两个24孔梳子。此设置提供了总共48个样本，可以同时进行分析。
   2. 准备以下试剂:40％丙烯酰胺 - 双19:1,5x TBE（Tris-Borate-EDTA pH 8.0），TEMED和10％APS（过硫酸铵）。
2. 生成10％天然丙烯酰胺凝胶。
   1. 在500mL烧瓶中，加入80mL 5x TBE，100mL 40％丙烯酰胺和水，至最终体积为400mL。
   2. 加入4 mL 10％APS和400μLTEMED。混合好
   3. 将混合物倒入水平铸造托盘中，使凝胶聚合30分钟。凝胶将约2厘米厚。
      注意:凝胶可以放入通风橱中加速聚合。聚合后，薄层的液体将保留在凝胶的顶部。
   4. 将液体倒出并用运行缓冲液冲洗。小心地取出梳子，使用注射器用运行缓冲液冲洗孔。
3. 准备运行缓冲区。
   1. 为凝胶盒准备2 L 1x TBE运行缓冲液。用1600 mL稀释400 mL 5XTBE并混合。将1x TBE缓冲液放在冷藏室中冷却。
4. 预运行凝胶
   1. 将2升冷运行缓冲液加入凝胶盒中并插入凝胶。
   2. 在冷藏室中，在4℃下将凝胶在120V预处理1小时。在此期间，制备结合反应。

绑定反应⁸

1. 2.1。制备以下反应组分。
   20 mM DTT
   10mM BSA
   10mM酵母tRNA
   5X结合缓冲液（50mM HEPES pH 8.0,5mM EDTA，0mM KCl，0.2％Tween-20）
   购自商业上购买的100nM荧光素标记的RNA
   浓缩Bicaudal-C蛋白
   在DEPC处理的H ₂ O中的50％甘油
   DEPC处理的H ₂ O
2. 在无RNA酶的微量离心管中装配结合反应组分。
   1. 向管中加入5μL的10mM BSA，5μL的20mM DTT，5μL的10mM酵母tRNA，10μL的5x结合缓冲液。
3. 在50μL中加入最终浓度为250 nM的蛋白。加水至最终体积为45μL。
4. 加入5μL荧光标记的RNA底物。使用商业上购买的3'荧光素标记的32核苷酸底物。
5. 在室温下混合并在黑暗中孵育30分钟。

3.天然水平聚丙烯酰胺凝胶样品分析

1. 在每次反应中，加入15μL50％甘油，轻轻混匀。
2. Carefu每次反应加入30μL凝胶。可以装入单个孔的样品量根据凝胶的厚度和孔的大小而变化。我们已经将体积少至15μL和多达45μL加入到用24孔梳子制成的单个孔中，并且倾倒到2cm的厚度。
3. 将电源连接到凝胶装置开关电源并调节电压。在120℃下在4℃下运行凝胶。
   注意:对于水平凝胶装置，其结果为约5V / cm。对于垂直凝胶装置，这是16 V / cm。
   1. 为了防止荧光标记的RNA的破坏或漂白，在黑暗中进行电泳。
   2. 根据正在分析的RNA-蛋白质复合物的特异性而改变电泳时间。
      注意:水平EMSA分析的主要优点是可以停止电泳，凝胶成像，然后再进行电泳l可以放回装置，电泳可以持续更长时间。

凝胶成像

1. 使用任何设计用于检测和成像荧光底物的仪器进行分析。
2. 将凝胶放在成像仪上。
3. 调整成像器设置。对于荧光素标记的RNA配体，请使用以下设置:FAM（波长473 nm），750倍光电倍增管电压（PMT），100μm像素大小。
4. 扫描凝胶以捕获图像。

结果

为了证明水平天然凝胶电泳的功能和多功能性，我们分析了非洲爪蟾 Bicaudal-C（Bicc1）蛋白与含有Bicc1结合位点的荧光标记RNA的结合。 Bicc1蛋白用作特异性mRNA翻译阻遏期间动物发展^{9，10，11，12}的母体阶段以及特定器官的成人^13,14

讨论

非变性聚丙烯酰胺凝胶是用于研究蛋白质-RNA相互作用和传统上这些凝胶是垂直电泳^2,3的宝贵工具。我们已经使用该替代创建和水平^{1，4，6，7，15}电泳天然聚丙烯酰胺凝胶的协议的修改。与荧光标记的RNA底物组合使用的这些变化为?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8