Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN

Resumen

La electroforesis en gel de poliacrilamida nativa es una herramienta fundamental para analizar las interacciones ARN-proteína. Tradicionalmente, la mayoría de los experimentos han utilizado geles verticales. Sin embargo, los geles horizontales proporcionan varias ventajas, tales como la oportunidad de monitorizar complejos durante la electroforesis. Proporcionamos un protocolo detallado para generar y usar electroforesis en gel nativa horizontal.

Resumen

La electroforesis nativa de gel de poliacrilamida es una herramienta fundamental de la biología molecular que se ha utilizado ampliamente para el análisis bioquímico de las interacciones ARN-proteína. Estas interacciones se han analizado tradicionalmente con geles de poliacrilamida generados entre dos placas de vidrio y muestras sometidas a electroforesis vertical. Sin embargo, los geles de poliacrilamida moldeados en bandejas y sometidos a electroforesis horizontalmente ofrecen varias ventajas. Por ejemplo, los geles horizontales utilizados para analizar complejos entre sustratos de ARN fluorescentes y proteínas específicas pueden ser visualizados múltiples veces a medida que avanza la electroforesis. Esto proporciona la oportunidad única de monitorear los complejos ARN-proteína en varios puntos durante el experimento. Además, la electroforesis en gel horizontal hace posible analizar muchas muestras en paralelo. Esto puede facilitar enormemente los experimentos en el curso del tiempo, así como analizar múltiples reacciones simultáneamente para comparar diferentes componentes y condiciones. Aquí estamosOvide un protocolo detallado para generar y usar electroforesis en gel nativa horizontal para analizar las interacciones ARN-Proteína.

Introducción

Los ensayos electroforéticos de cambio de movilidad (EMSA) han demostrado ser una herramienta bioquímica inestimable para analizar las interacciones proteína-ácido nucleico específicas ^{1 , 2 , 3} . Estos ensayos pueden proporcionar información importante con respecto a la afinidad de unión de las proteínas al ARN o al ADN ³ , a la estequiometría de componentes de los complejos ácido nucleico-proteína ¹ y aportan nuevas e importantes ideas sobre la especificidad de unión de las proteínas de unión al ARN mediante experimentos de competición de sustratos ¹ .

La configuración experimental tradicional para estos ensayos consiste en mezclar proteína purificada con un sustrato de ARN radiomarcado. Los complejos resultantes se analizan a continuación con geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (nativos) vertidos entre dos placas de vidrio seguido por electroforesis de muestra en un aparato vertical ³. Si bien este enfoque se ha utilizado exhaustivamente para proporcionar importantes conocimientos en los mecanismos bioquímicos que subyacen a la unión de proteínas a los ácidos nucleicos, también tiene varias limitaciones. Por ejemplo, esta estrategia básica tiene un rendimiento relativamente bajo y no es fácilmente adaptable para aplicaciones que requieren analizar muchas reacciones de unión en paralelo. Además, con el aparato vertical tradicional es un desafío para potencialmente monitor de complejos en múltiples ocasiones durante la electroforesis [ ^{3 , 4]} .

Aquí presentamos una adaptación del ensayo EMSA que utiliza geles nativos de poliacrilamida moldeados en un aparato de superficie plana, electroforesis horizontal y sustratos de ARN marcados fluorescentemente ^{4 , 5 , 6 , 7} . La incorporación de estas modificaciones relativamente simples a laTegy ofrece algunas ventajas poderosas. En particular, el formato de superficie plana horizontal se presta fácilmente para analizar docenas de muestras simultáneamente ⁴ . También, para algunos complejos de ARN-proteína, tales como los formados entre la proteína Bicaudal-C y su electroforesis de sustrato de ARN en un gel horizontal proporciona una mayor capacidad para resolver complejos de ARN-proteína distintos y discriminar éstos a partir del sustrato de ARN no unido.

Protocolo

1. Preparación del gel de poliacrilamida nativa horizontal ⁴ .

1. Preparación de los materiales necesarios.
   1. Para el aparato de gel horizontal, utilice una caja de gel (37 cm x 24 cm) con una bandeja de 27 cm x 21 cm y una capacidad para dos peines de 24 pocillos. Esta configuración proporciona un total de 48 muestras que pueden analizarse simultáneamente.
   2. Preparar los siguientes reactivos: 40% de Acrilamida-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED y 10% de APS (persulfato de amonio).
2. Generación de un gel natural de acrilamida al 10%.
   1. En un matraz de 500 ml, se añaden 80 ml de TBE 5x, 100 ml de acrilamida al 40% y agua hasta un volumen final de 400 ml.
   2. Añadir 4 ml de APS al 10% y 400 μl de TEMED. Mezclar bien.
   3. Verter la mezcla en la bandeja de colada horizontal y dejar que el gel se polimerice durante 30 min. El gel tendrá aproximadamente 2 cm de espesor.
      NOTA: Los geles pueden fundirse en una campana para acelerarPolimerización. Después de la polimerización, una fina capa de líquido permanecerá en la parte superior del gel.
   4. Vierta el líquido y enjuague con buffer de funcionamiento. Retire el (los) peine (s) cuidadosamente y enjuague los pocillos con tampón de funcionamiento con una jeringa.
3. Preparación del tampón de funcionamiento.
   1. Preparar 2 L de tampón de funcionamiento 1x TBE para la caja de gel. Diluir 400 ml de 5XTBE con 1600 ml y mezclar. Coloque el tampón TBE 1x en la habitación fría para enfriar.
4. Pre-Ejecutar el gel
   1. Añadir 2 l de buffer de funcionamiento en frío a la caja de gel e insertar el gel.
   2. Pre-ejecutar el gel a 120 V durante 1 h a 4 ° C en una habitación fría. Durante este tiempo, preparar la reacción de unión.

2. Reacción de unión ⁸

1. 2.1.Preparar los siguientes componentes de la reacción.
   DTT 20 mM
   BSA 10 mM
   10 mM de ARNt de levadura
   5X (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 25KCl 0 mM, Tween-20 al 0,2%),
   100 nM de ARN marcado con fluoresceína comprado comercialmente
   Concentrado de proteína Bicaudal-C
   Glicerol al 50% en H _ { _2} O
   H ₂ O tratado con DEPC
2. Ensamble los componentes de la reacción de unión en un tubo de microcentrífuga libre de RNasa.
   1. Añadir al tubo 5 μl de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL de tRNA de levadura 10 mM, 10 μl de Tampón de Unión 5x.
3. Añadir proteína a una concentración final de 250 nM en 50 μ l. Añadir agua hasta un volumen final de 45 μl.
4. Añadir 5 μl de sustrato de ARN marcado fluorescentemente. Utilizar un sustrato de 32 nucleótidos marcado con fluoresceína comercialmente comprado en 3 '.
5. Mezclar e incubar en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente.

3. Análisis de muestras sobre el gel de poliacrilamida horizontal nativo

1. A cada reacción, añadir 15 μL de glicerol al 50% y mezclar suavemente.
2. CarefuAgregue 30 μL de cada reacción al gel. La cantidad de muestra que puede cargarse en un solo pocillo varía dependiendo del espesor del gel y del tamaño de los pocillos. Hemos cargado volúmenes tan poco como 15 μL y hasta 45 μL en un solo pozo de geles creados con un peine de 24 pocillos y vertidos hasta un espesor de 2 cm.
3. Después de conectar la fuente de alimentación al aparato del gel encender la energía y ajustar la tensión. Ejecutar el gel a 4 ° C a 120 V.
   NOTA: Para el aparato de gel horizontal, éste termina siendo de aproximadamente 5 V / cm. Para el aparato de gel vertical, éste es de 16 V / cm.
   1. Para evitar dañar o blanquear el ARN marcado fluorescentemente, conduzca la electroforesis en la oscuridad.
   2. Varían los tiempos de electroforesis dependiendo de los específicos del complejo ARN-proteína que se está analizando.
      NOTA: Una ventaja importante del análisis EMSA horizontal es que se puede detener la electroforesis, la imagen del gel y luego la geL se puede volver a colocar en el aparato y la electroforesis puede continuar durante más tiempo.

4. Imaging el gel

1. Realice el análisis con cualquier instrumento diseñado para la detección e imagenología de sustratos fluorescentes.
2. Coloque el gel en la cámara.
3. Ajuste los ajustes del imager. Para los ligandos de ARN marcados con fluoresceína, utilice los siguientes ajustes: FAM (longitud de onda 473 nm), 750 Voltaje del fotomultiplicador (PMT), 100 μm de tamaño de píxel.
4. Escanee el gel para capturar la imagen.

Resultados

Para demostrar la potencia y versatilidad de la electroforesis horizontal en gel natural se analizó la unión de la proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un ARN marcado fluorescentemente que contenía un sitio de unión a Bicc1. Las proteínas Bicc1 funcionan como represores translacionales específicos de mRNA para controlar las decisiones de destino celular durante las etapas maternas de desarrollo animal ^{9 , 10}

Discusión

Los geles nativos de poliacrilamida son una herramienta invaluable para investigar las interacciones proteína-ARN y tradicionalmente estos geles son sometidos a electroforesis vertical ^{2 , 3} . Hemos utilizado una modificación del protocolo que sustituye los geles de poliacrilamida nativos creados y electrophoresed horizontalmente ^{1 , 4 , 6 ,}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8