タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

要約

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための基本的なツールです。伝統的に、ほとんどの実験では垂直ゲルが使用されています。しかしながら、水平ゲルは、電気泳動の間に複合体をモニターする機会のようないくつかの利点を提供する。我々は、水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコールを提供する。

要約

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用の生化学的分析に広範に使用されている分子生物学の基本的ツールである。これらの相互作用は、伝統的に、2枚のガラスプレートの間に生成されたポリアクリルアミドゲルおよび垂直に電気泳動されたサンプルで分析されてきた。しかし、ポリアクリルアミドゲルは、トレイにキャスティングされ、水平に電気泳動されると、いくつかの利点をもたらす。例えば、蛍光RNA基質と特定のタンパク質との間の複合体を分析するために使用される水平ゲルは、電気泳動が進行するにつれて複数回画像化することができる。これは、実験中のいくつかの時点でRNA-タンパク質複合体をモニターする独特の機会を提供する。さらに、水平ゲル電気泳動は、多数の試料を並行して分析することを可能にする。これは、時間経過の実験を大幅に促進するだけでなく、複数の反応を同時に分析して、異なる成分および条件を比較することができる。ここで私たちはprRNA-タンパク質相互作用を分析するための水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコルを提供する。

概要

電気泳動移動度泳動シフトアッセイ（EMSA）は、特定のタンパク質-核酸相互作用^1、2、3を分析するため^の貴重な生化学的ツールであることが証明されています。これらのアッセイは、核酸 - タンパク質複合体¹の成分化学量論であるRNAまたはDNA ³に対するタンパク質の結合親和性に関する重要な情報を提供し、基質競合実験^1を介したRNA結合タンパク質の結合特異性に関する重要な新しい洞察を提供する。

これらのアッセイのための従来の実験装置は、精製されたタンパク質を放射性標識されたRNA基質と混合することからなる。次いで、得られた複合体を、2つのガラスプレートの間に注がれた非変性（天然）ポリアクリルアミドゲルで分析し、次いで垂直装置³でサンプル電気泳動を行う。このアプローチは、タンパク質の核酸への結合の基礎をなす生化学的メカニズムにおける重要な洞察を提供するために徹底的に使用されてきたが、いくつかの制限もある。例えば、この基本戦略はスループットが比較的低く、多くの結合反応を並行して分析する必要がある用途には容易に適応できない。加えて、従来の縦型装置では、潜在的に電気泳動^{図3、 図4}中に複数回に錯体を監視することが困難です。

ここでは、フラットベッド装置で鋳造ネイティブポリアクリルアミドゲル、水平電気泳動および蛍光標識されたRNA基質^{4、5、6、7を}使用するEMSAアッセイの適応を提示します。これらの比較的簡単な変更を基本的なひずみに組み込むことtegyはいくつかの強力な利点を提供します。特に、水平フラットベッドフォーマットは、数十のサンプルを同時に分析するのに適しています⁴ 。また、Bicaudal-Cタンパク質とそのRNA基質との間に形成されるRNA-タンパク質複合体の場合、水平ゲル中での電気泳動は、異なるRNA-タンパク質複合体を分離し、これらを非結合RNA基質から区別する能力を高める。

プロトコル

水平ネイティブポリアクリルアミドゲルの調製⁴ 。

1. 必要な材料の準備。
   1. 水平ゲル装置の場合は、27cm×21cmのトレイを備えたゲルボックス（37cm×24cm）を使用し、2つの24ウェルコームの容量を使用します。この設定では、合計48個のサンプルを同時に分析できます。
   2. 40％アクリルアミド - ビス19：1,5x TBE（Tris-ボレート-EDTA pH8.0）、TEMED、および10％APS（過硫酸アンモニウム）の試薬を調製する。
2. 10％天然アクリルアミドゲルの生成。
   1. 500mLのフラスコに、80mLの5×TBE、100mLの40％アクリルアミド、および水を最終容量400mLまで加える。
   2. 10％APS 4mLとTEMED400μLを加える。よく混ぜます。
   3. 混合物を水平キャスティングトレーに注ぎ、ゲルを30分間重合させる。ゲルの厚さは約2cmです。
      注：ゲルはヒュームフードでキャストしてスピードを上げることができます重合を開始する。重合後、薄い液体層がゲルの上に残る。
   4. 液体を注ぎ、ランニングバッファーですすいでください。慎重に櫛を外し、シリンジを使用してランニングバッファーでウェルをリンスします。
3. ランニングバッファーの準備。
   1. ゲルボックス用の1x TBEランニングバッファー2 Lを調製する。 400mLの5XTBEを1600mLで希釈し、混合する。冷たい部屋に1x TBE緩衝液を入れて冷ます。
4. ゲルのプレ - ランニング
   1. 2Lの冷たいランニングバッファーをゲルボックスに加え、ゲルを挿入する。
   2. 冷たい部屋で4℃、1時間、120Vでゲルをプレランします。この間、結合反応を準備する。

2.結合反応⁸

1. 2.1。以下の反応成分を調製する。
   20mM DTT
   10mM BSA
   10mM酵母tRNA
   5X結合緩衝液（50mM HEPES pH8.0,5mM EDTA、25μl0mM KCl、0.2％Tween-20）
   市販されている100nMフルオレセイン標識RNA
   濃縮されたBicaudal-Cタンパク質
   DEPC処理H ₂ O中の50％グリセロール
   DEPC処理H ₂ O
2. 結合反応成分をRNaseフリーの微量遠心チューブに集める。
   1. チューブに、5μLの10mM BSA、5μLの20mM DTT、5μLの10mM酵母tRNA、10μLの5×Binding Bufferを加えます。
3. タンパク質を50μL中250nMの最終濃度に添加する。 45μLの最終容量に水を加える。
4. 5μLの蛍光標識RNA基質を添加する。市販の3 'フルオレセイン標識32-ヌクレオチド基質を使用する。
5. 混合し、室温で30分間暗所でインキュベートする。

3.ネイティブ水平ポリアクリルアミドゲル上の試料の分析

1. 各反応に、50μLのグリセロール15μLを添加し、穏やかに混合する。
2. ケアフー各反応液30μLをゲルに加える。単一のウェルに充填することができる試料の量は、ゲルの厚さおよびウェルのサイズに依存して変化する。私たちは、24ウェルの櫛で作製したゲルの1ウェルに、15μLと45μLという少量を充填し、2cmの厚さに注いだ。
3. 電源をゲル装置のスイッチに接続して電源を入れ、電圧を調整します。ゲルを4℃、120Vで反応させる。
   注：水平ゲル装置の場合、これは約5V / cmになる。縦型ゲル装置の場合、これは16V / cmである。
   1. 蛍光標識されたRNAの損傷または漂白を防ぐために、暗所で電気泳動を行います。
   2. 分析されるRNA-タンパク質複合体の特性に応じて電気泳動時間を変化させる。
      注：水平EMSA分析の主な利点は、電気泳動を停止し、ゲルを画像化し、次にゲルlを装置に戻すことができ、電気泳動をより長い時間続けることができる。

4.ゲルのイメージング

1. 蛍光基質の検出とイメージング用に設計された任意の機器で分析を行います。
2. イメージャにゲルを置きます。
3. イメージャの設定を調整します。フルオレセイン標識RNAリガンドについては、以下の設定を用いる：FAM（波長473nm）、750光電子増倍管電圧（PMT）、100μmピクセルサイズ。
4. ゲルをスキャンして画像をキャプチャします。

結果

水平ネイティブゲル電気泳動の力と汎用性を実証するために、我々はBicc1結合部位を含む蛍光標識されたRNAをアフリカツメガエル Bicaudal-C（Bicc1）タンパク質の結合を分析しました。 Bicc1タンパク質は^、動物の開発⁹の母体段階の間の細胞運命決定を制御するために、mRNAを特異的翻訳リプレッサーとして機能

ディスカッション

ネイティブポリアクリルアミドゲルは、タンパク質-RNA相互作用を調査し、伝統的に、これらのゲルを上下に^2、3電気泳動するための貴重なツールです。我々が作成され、水平方向に^{1、4、6、7、15}電気泳動ネイティブポリアクリ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8