Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Riepilogo

L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale per analizzare le interazioni tra proteine ​​RNA. Tradizionalmente la maggior parte degli esperimenti hanno utilizzato gel verticale. Tuttavia, i gel orizzontali offrono diversi vantaggi, come l'opportunità di monitorare i complessi durante l'elettroforesi. Forniamo un protocollo dettagliato per la generazione e l'uso di elettroforesi geotermica orizzontale.

Abstract

L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale della biologia molecolare che è stato usato ampiamente per l'analisi biochimica delle interazioni di proteine ​​RNA. Queste interazioni sono state tradizionalmente analizzate con gel di poliacrilammide generati tra due lastre di vetro e campioni elettroforati verticalmente. Tuttavia, i gel di poliacrilamide gettati in vassoi e elettroforesi orizzontalmente offre diversi vantaggi. Ad esempio, i gel orizzontali utilizzati per analizzare complessi tra substrati di RNA fluorescenti e proteine ​​specifiche possono essere riprese più volte come l'avanzamento dell'elettroforesi. Questo fornisce l'opportunità unica di monitorare complessi proteina RNA in diversi punti durante l'esperimento. Inoltre, l'elettroforesi orizzontale a gel permette di analizzare molti campioni in parallelo. Ciò può notevolmente facilitare esperimenti di tempo e analizzare più reazioni simultaneamente per confrontare componenti e condizioni differenti. Qui abbiamo prOvide un protocollo dettagliato per la generazione e l'utilizzo di elettroforesi geotermica orizzontale per l'analisi delle interazioni RNA-Protein.

Introduzione

I test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSAs) hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso biochimico per analizzare le interazioni specifiche dell'acido nucleico-proteico ^{1 , 2 , 3} . Questi test possono fornire informazioni importanti riguardo all'affinità di legame delle proteine ​​all'RNA o al DNA ³ , la stechiometria del complesso ^{1 dei} proteine ​​nucleici e fornire importanti novità circa la specificità di legame delle proteine ​​legate all'RNA tramite esperimenti di concorrenza del substrato ¹ .

La configurazione sperimentale tradizionale per questi dosaggi consiste nel mescolare la proteina purificata con un substrato RNA radiomarcato. I complessi risultanti vengono poi analizzati con gel di poliacrilammide non denaturanti (nativi) versati tra due lastre di vetro seguite da elettroforesi di campione in un apparecchio verticale ³. Mentre questo approccio è stato utilizzato in modo esaustivo per fornire importanti conoscenze nei meccanismi biochimici che sono alla base del legame delle proteine ​​agli acidi nucleici, ha anche diverse limitazioni. Ad esempio, questa strategia di base ha un rendimento relativamente basso e non è facilmente adattabile per applicazioni che richiedono l'analisi di molte reazioni vincolanti in parallelo. Inoltre, con l'apparato verticale tradizionale è impegnativo monitorare potenzialmente complessi in più volte durante l'elettroforesi ^{3 , 4} .

Qui presentiamo un adattamento del test EMSA che utilizza gel naturali di poliacrilammide gettate in un apparecchio pianale, elettroforesi orizzontale e sostanze RNA a fluorescenza ^{4 , 5 , 6 , 7} . L'incorporazione di queste modifiche relativamente semplici alla base straTegy fornisce alcuni potenti vantaggi. In particolare, il formato orizzontale a piattaforma si presta facilmente ad analizzare contemporaneamente dozzine di campioni ⁴ . Inoltre, per alcuni complessi di proteine ​​RNA, come quelle formate tra la proteina Bicaudal-C e l'elettroforesi del suo substrato RNA in un gel orizzontale, fornisce una maggiore capacità di risolvere complessi distinti di proteine ​​RNA e di discriminarli dal substrato RNA non legato.

Protocollo

1. Preparazione del Gel Naturale Orizzontale di Polyacrylamide ⁴ .

1. Preparazione dei materiali necessari.
   1. Per l'apparecchio a gel orizzontale, utilizzare una scatola di gel (37 cm x 24 cm) con vassoio da 27 cm x 21 cm e una capacità per due pettini a 24 pozzetti. Questa impostazione fornisce un totale di 48 campioni che possono essere analizzati contemporaneamente.
   2. Preparare i reagenti seguenti: 40% Acrilammide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (ammonio persolfato).
2. Generazione di un gel nativo di acrilammide al 10%.
   1. In un pallone da 500 mL, aggiungere 80 mL di 5x TBE, 100 mL di acrilammide al 40% ed acqua fino ad un volume finale di 400 mL.
   2. Aggiungere 4 mL di APS 10% e 400 μL di TEMED. Mescolare bene.
   3. Versare il mix nel vassoio di fusione orizzontale e lasciare che il gel si polimerizza per 30 min. Il gel sarà di circa 2 cm di spessore.
      NOTA: I gel possono gettare in una cappa di fumo per velocizzarePolimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, un sottile strato di liquido rimarrà in cima al gel.
   4. Versare il liquido e sciacquare con il tampone di funzionamento. Rimuovere attentamente i pettini e sciacquare i pozzetti con il tampone in esecuzione utilizzando una siringa.
3. Preparazione del buffer di esecuzione.
   1. Preparare 2 L di buffer di esecuzione 1x TBE per la scatola del gel. Diluire 400 mL di 5XTBE con 1600 mL e mescolare. Posizionare il tampone 1x TBE in camera fredda per raffreddarsi.
4. Pre-eseguire il gel
   1. Aggiungere 2 l di tampone di freddo alla scatola del gel e inserire il gel.
   2. Pre-eseguire il gel a 120 V per 1 ora a 4 ° C in una stanza fredda. Durante questo tempo, preparare la reazione di legame.

2. Reazione legante ⁸

1. 2.1.Prepare i seguenti componenti di reazione.
   20 mM DTT
   10 mM BSA
   10 mM tRNA di lievito
   5X buffer di legame (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
   100 nM fluoresceina etichettata RNA acquistata in commercio
   Proteina Bicaudal-C concentrata
   50% glicerolo in trattata con DEPC H ₂ O
   Trattata con DEPC H ₂ O
2. Montare i componenti di reazione di binding in un tubo di microcentrifuga libero di RNase.
   1. Al tubo aggiungere 5 μl di 10 mM BSA, 5 μL di 20 mM DTT, 5 μL di tRNA 10 mM di lieviti, 10 μl di 5X Binding Buffer.
3. Aggiungere la proteina ad una concentrazione finale di 250 nM in 50 μL. Aggiungere acqua a un volume finale di 45 μL.
4. Aggiungere 5 μL di substrato RNA a fluorescenza. Utilizzare un substrato a 32 nucleotidi etichettato con fluoresceina 3 'commercialmente acquistato.
5. Mescolare e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.

3. Analisi dei campioni sul Gel nativo orizzontale di poliacrilammide

1. Ad ogni reazione aggiungere 15 μl di glicerolo al 50% e mescolare delicatamente.
2. CarefuAggiungere 30 μL di ogni reazione al gel. La quantità di campione che può essere caricata in un pozzo singolo varia a seconda dello spessore del gel e della dimensione dei pozzetti. Abbiamo caricato volumi fino a 15 μL e fino a 45 μL in un unico pozzetto di gel creato con un pettine da 24 pozzetti e versato allo spessore di 2 cm.
3. Dopo aver collegato l'alimentazione elettrica all'interruttore dell'apparecchio di alimentazione del gel e regolate la tensione. Eseguire il gel in 4 ° C a 120 V.
   NOTA: per l'apparecchiatura orizzontale del gel, questo finisce per essere circa 5 V / cm. Per l'apparecchiatura verticale del gel, questo è 16 V / cm.
   1. Per evitare danni o sbiancamento del RNA a fluorescenza, eseguire elettroforesi al buio.
   2. Varianti di elettroforesi a seconda delle specificità del complesso proteico RNA in fase di analisi.
      NOTA: Un importante vantaggio dell'analisi orizzontale EMSA è che l'elettroforesi può essere interrotta, il gel che è stato imaged e poi il gePuò essere posizionato nell'apparecchio e l'elettroforesi può essere continuata per tempi più lunghi.

4. Imaging del gel

1. Eseguire analisi con qualsiasi strumento progettato per rilevare e riprodurre substrati fluorescenti.
2. Posizionare il gel sull'immagine.
3. Regolare le impostazioni dell'immagine. Per i ligandi RNA con etichettatura fluoresceina, utilizzare le seguenti impostazioni: FAM (lunghezza d'onda 473 nm), 750 tensione fotomoltiplicatrice (PMT), dimensioni di 100 μm pixel.
4. Scansiona il gel per catturare l'immagine.

Risultati

Per dimostrare la potenza e la versatilità dell'elettroforesi gel geo orizzontale abbiamo analizzato il legame della proteina Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un RNA a fluorescenza etichettato contenente un sito di legame Bicc1. Le proteine ​​Bicc1 funzionano come repressori transazionali trasversali mRNA per controllare le decisioni del destino cellulare durante le fasi materne dello sviluppo animale ^{9 , 10 ,<...}

Discussione

I gel naturali di polyacrylamide sono uno strumento prezioso per indagare le interazioni proteina-RNA e tradizionalmente questi gel sono elettroforizzati verticalmente ^{2 , 3} . Abbiamo utilizzato una modifica del protocollo che sostituisce gel naturali di poliacrilammide creati ed elettroforesi orizzontalmente ^{1 , 4 , 6 , 7 ,}...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8