Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN

Résumé

L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.

Résumé

L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l'analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l'horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d'ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l'électrophorèse progresse. Cela fournit l'occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l'expérience. De plus, l'électrophorèse sur gel horizontale permet d'analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.

Introduction

Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques ^{1 , 2 , 3} . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l'affinité de liaison des protéines à l'ARN ou à l'ADN ³ , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines ¹ et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison de l'ARN par des expériences de compétition de substrat ¹ .

La configuration expérimentale traditionnelle pour ces essais consiste à mélanger une protéine purifiée avec un substrat d'ARN radiomarqué. Les complexes résultants sont ensuite analysés avec des gels de polyacrylamide non dénaturants (natifs) versés entre deux plaques de verre suivies d'une électrophorèse d'échantillon dans un appareil vertical ³. Bien que cette approche ait été utilisée de manière exhaustive pour fournir des informations importantes sur les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la liaison des protéines aux acides nucléiques, elle a également plusieurs limites. Par exemple, cette stratégie de base a un débit relativement faible et n'est pas facilement adaptable pour les applications nécessitant l'analyse de plusieurs réactions de liaison en parallèle. En outre, avec l'appareil vertical traditionnel, il est difficile de surveiller potentiellement les complexes à plusieurs reprises lors de l'électrophorèse ^{3 , 4} .

Nous présentons ici une adaptation du dosage EMSA qui utilise des gels de polyacrylamide natifs coulés dans un appareil à plat, une électrophorèse horizontale et des substrats d'ARN marqués par fluorescence ^{4 , 5 , 6 , 7} . L'incorporation de ces modifications relativement simples à la base straTegy offre de nombreux avantages. En particulier, le format à plat horizontal se prête facilement à analyser des dizaines d'échantillons simultanément ⁴ . En outre, pour certains complexes ARN-protéines, tels que ceux formés entre la protéine Bicaudal-C et son électrophorèse au substrat d'ARN dans un gel horizontal, offre une capacité accrue à résoudre des complexes distincts de protéines d'ARN et à les discriminer à partir de substrat d'ARN non lié.

Protocole

1. Préparation du gel de polyacrylamide natif horizontal ⁴ .

1. Préparation des matériaux nécessaires.
   1. Pour l'appareil de gel horizontal, utilisez une boîte en gel (37 cm x 24 cm) avec un plateau de 27 cm x 21 cm et une capacité pour deux peignes de 24 po. Cette configuration fournit un total de 48 échantillons qui peuvent être analysés simultanément.
   2. Préparez les réactifs suivants: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED et 10% APS (persulfate d'ammonium).
2. Génération d'un gel d'acrylamide natif à 10%.
   1. Dans un ballon de 500 mL, ajouter 80 mL de 5x TBE, 100 mL d'acrylamide à 40% et de l'eau à un volume final de 400 ml.
   2. Ajouter 4 mL d'APS à 10% et 400 μL de TEMED. Bien mélanger.
   3. Verser le mélange dans le bac de coulée horizontale et laisser le gel polymériser pendant 30 min. Le gel aura environ 2 cm d'épaisseur.
      REMARQUE: Les gels peuvent couler dans une hotte pour accélérerJusqu'à la polymérisation. Après la polymérisation, une fine couche de liquide restera sur le dessus du gel.
   4. Verser le liquide et rincer avec le tampon courant. Retirez le (s) peigne (s) avec précaution et rincez les puits avec un tampon courant à l'aide d'une seringue.
3. Préparation du tampon courant.
   1. Préparez 2 L de 1x tampon de fonctionnement TBE pour la boîte à gel. Diluer 400 ml de 5XTBE avec 1600 ml et mélanger. Placez le tampon TBE dans la chambre froide pour refroidir.
4. Pré-exécuter le gel
   1. Ajouter 2 L de tampon de fonctionnement à froid dans la boîte à gel et insérer le gel.
   2. Pré-exécuter le gel à 120 V pendant 1 h à 4 ° C dans une chambre froide. Pendant ce temps, préparez la réaction de liaison.

2. Réaction de liaison ⁸

1. 2.1.Préparez les composants de réaction suivants.
   DTT 20 mM
   BSA 10 mM
   10 mM d'ARNt de levure
   5X tampon de liaison (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM de KCl, 0,2% de Tween-20)
   L'ARN marqué à la fluorescéine 100 nM a été acheté commercialement
   Concentré de protéine Bicaudal-C
   50% de glycérol dans H ₂ O traité par DEPC
   H ₂ O traité par DEPC
2. Assembler les composants de réaction de liaison dans un tube de microcentrifugeuse sans RNase.
   1. Au tube, ajouter 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL d'ARNt de levure 10 mM, 10 μL de 5x Binding Buffer.
3. Ajouter une protéine à une concentration finale de 250 nM dans 50 μL. Ajouter de l'eau à un volume final de 45 μL.
4. Ajouter 5 μL de substrat d'ARN marqué par fluorescence. Utiliser un substrat de 32 nucleotides marqué par fluorescéine 3 'commercialement acheté.
5. Mélanger et incuber dans l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.

3. Analyse des échantillons sur le gel de polyacrylamide horizontal natif

1. Pour chaque réaction, ajouter 15 μL de 50% de glycerol et mélanger doucement.
2. CarefuAjouter 30 μL de chaque réaction au gel. La quantité d'échantillon qui peut être chargée dans un puits unique varie en fonction de l'épaisseur du gel et de la taille des puits. Nous avons chargé des volumes aussi peu que 15 μL et jusqu'à 45 μL dans un seul puits de gels créé avec un peigne de 24 po et versé à une épaisseur de 2 cm.
3. Après avoir connecté l'alimentation à l'appareil gel, allumez l'alimentation et réglez la tension. Faire passer le gel à 4 ° C à 120 V.
   REMARQUE: pour l'appareil de gel horizontal, cela finit par être d'environ 5 V / cm. Pour l'appareil de gel vertical, il s'agit de 16 V / cm.
   1. Pour éviter d'endommager ou blanchir l'ARN marqué par fluorescence, effectuer une électrophorèse dans l'obscurité.
   2. Varier les temps d'électrophorèse en fonction des spécificités du complexe ARN-protéine analysé.
      REMARQUE: Un avantage majeur de l'analyse EMSA horizontale est que l'électrophorèse peut être arrêtée, le gel imagé et ensuite le géJe peux être replacé dans l'appareil et l'électrophorèse peut être poursuivie pendant plus longtemps.

4. Imagerie du Gel

1. Effectuer une analyse avec n'importe quel instrument conçu pour la détection et l'imagerie de substrats fluorescents.
2. Placez le gel sur l'imageur.
3. Régler les paramètres de l'image. Pour les ligands d'ARN marqués à la fluorescéine, utilisez les paramètres suivants: FAM (longueur d'onde 473 nm), 750 Tension de photomultiplicateur (PMT), taille de pixel de 100 μm.
4. Scannez le gel pour capturer l'image.

Résultats

Pour démontrer la puissance et la polyvalence de l'électrophorèse en gel native horizontale, nous avons analysé la liaison de la protéine Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) à un ARN marqué par fluorescence contenant un site de liaison Bicc1. Bicc1 protéines fonctionnent comme des répresseurs pour contrôler traductionnelles spécifiques à l'ARNm de décisions du destin cellulaire au cours des étapes maternelles de développement des animaux ^9,

Discussion

Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement ^{2 , 3} . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale ^{1 , 4 , 6 ,}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8