ג 'ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ"א קומפלקסים

Summary

יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי לניתוח אינטראקציות רנ"א חלבון. באופן מסורתי רוב הניסויים השתמשו בג'לים אנכיים. עם זאת, ג 'לים אופקית לספק מספר יתרונות, כגון הזדמנות לפקח מתחמי במהלך אלקטרופורזה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקי גלוקל אלקטרופורזה הילידים.

Abstract

יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי של ביולוגיה מולקולרית אשר שימש בהרחבה לניתוח ביוכימי של אינטראקציות רנ"א חלבון. אינטראקציות אלה ניתחו באופן מסורתי עם ג'ל polyacrylamide שנוצר בין שתי צלחות זכוכית דגימות electrophoresed אנכית. עם זאת, ג 'ל polyacrylamide יצוק מגשים electrophoresed אופקית מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, ג 'לים אופקי המשמש כדי לנתח מתחמי בין מצעים RNA פלואורסצנטי חלבונים ספציפיים ניתן הדמיה מספר פעמים כמו אלקטרופורזה מתקדמת. זה מספק הזדמנות ייחודית לפקח על מתחמי RNA חלבונים בכמה נקודות במהלך הניסוי. בנוסף, אלקטרופורזה ג'ל אופקית מאפשרת לנתח דוגמאות רבות במקביל. זה יכול מאוד להקל על הניסויים כמובן כמובן, כמו גם ניתוח של מספר רב של תגובות בו זמנית להשוות רכיבים שונים ותנאים. הנה אנחנו יחסי ציבורOvide פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקית אלקטרופורזה הילידים אופקי לניתוח אינטראקציות RNA-Protein.

Introduction

מבחני מעבר ניידות אלקטרופורטית (EMSAs) הוכיחו להיות כלי ביוכימי שלא יסולא בפז לנתח אינטראקציות ספציפיות לחלבון-חומצה גרעינית ^{1 , 2 , 3} . מבחני אלה יכולים לספק מידע חשוב לגבי זיקה מחייב של חלבונים ל- RNA או DNA ³ , stoichiometry מרכיב של מתחמי חומצה גרעין ¹ ולספק תובנות חדשות חשובות על הייחודיות מחייב של חלבונים RNA מחייב באמצעות ניסויים בתחרות המצע ¹ .

ההגדרה הניסויית המסורתית עבור מבחני אלה מורכב ערבוב חלבון מטוהרים עם המצע RNA radiolabeled. מתחמי שהתקבלו לאחר מכן מנותחים עם הלא denaturing (יליד) ג 'ל polyacrylamide שפכו בין שתי צלחות זכוכית ואחריו electrophoresis מדגם במנגנון אנכי ³. בעוד גישה זו שימשה באופן ממצה כדי לספק תובנות חשובות במנגנונים הביוכימיים שבבסיס מחייב של חלבונים לחומצות גרעין, יש לה גם מספר מגבלות. לדוגמה, לאסטרטגיה בסיסית זו יש תפוקה נמוכה יחסית והיא אינה ניתנת להתאמה בקלות עבור יישומים הדורשים ניתוח של תגובות מחייבות רבות במקביל. בנוסף, עם המנגנון האנכי המסורתי זה מאתגר פוטנציאלי לפקח מתחמים במספר פעמים במהלך אלקטרופורזה ^{3 , 4} .

כאן אנו מציגים הסתגלות של assay EMSA המשתמשת ג 'ל polyacrylamide יליד יצוק מכשיר שטוח, אלקטרופורזה אופקית ו fluorescently שכותרתו RNA מצעים ^{4 , 5 , 6 , 7} . שילובם של שינויים פשוטים יחסית אלהTegy מספק כמה יתרונות חזקים. בפרט, פורמט שטוח אופקי בקלות משאיל את עצמו לנתח עשרות דגימות בו זמנית ⁴ . כמו כן, עבור כמה מתחמי RNA חלבונים, כגון אלה שנוצרו בין החלבון Bicaudal-C ו אלקטרופורזה המצע RNA שלה בג'ל אופקי מספק יכולת מוגברת כדי לפתור שונים RNA חלבונים מתחמי להפלות אלה ממצע רנ"א מאוגד.

Protocol

1. הכנת ג 'ל אופקי הילידים Polyacrylamide ג'ל ⁴ .

1. הכנת החומרים הדרושים.
   1. עבור מכשיר ג'ל אופקי, השתמש בתיבת ג'ל (37 ס"מ x 24 ס"מ) עם מגש 27 ס"מ x 21 ס"מ ויכולת עבור שתי מסרקים 24 היטב. התקנה זו מספקת סך של 48 דגימות שניתן לנתח בו זמנית.
   2. הכן את ריאגנטים הבאים: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED, ו 10% APS (persulfate אמוניום).
2. דור של 10% יליד אקרילמיד היל.
   1. בתוך בקבוק 500 מ"ל, מוסיפים 80 מ"ל של TBE 5x, 100 מ"ל של 40% acrylamide, ו מים נפח סופי של 400 מ"ל.
   2. הוסף 4 מ"ל של APS 10% ו 400 μL של TEMED. לערבב היטב.
   3. יוצקים את התערובת לתוך מגש הליהוק האופקי ומאפשרים את הג'ל לפלמור במשך 30 דקות. הג'ל יהיה בערך 2 ס"מ עובי.
      הערה: ג 'לים יכול להטיל על מכסה המנוע קטר כדי להאיץ- פילמור. לאחר פילמור, שכבה דקה של נוזל יישאר על גבי הג'ל.
   4. יוצקים את הנוזל ואת לשטוף עם חיץ פועל. הסר את המסרק (ים) בזהירות ולשטוף את הבארות עם חיץ פועל באמצעות מזרק.
3. הכנת מאגר חיץ.
   1. הכן 2 L של 1x TBE פועל מאגר עבור תיבת ג'ל. מדולל 400 מ"ל של 5XTBE עם 1600 מ"ל ומערבבים. מקום 1x TBE חיץ בחדר קר להתקרר.
4. טרום הפעלת ג'ל
   1. הוסף 2 L למאגר ריצה קר לתיבת ג'ל ולהכניס את הג'ל.
   2. טרום להפעיל את הג'ל ב 120 V במשך שעה 1 ב 4 ° C בחדר קר. במהלך תקופה זו, להכין את התגובה מחייב.

2. תגובה מחייב ⁸

1. 2.1.הכנה את רכיבי התגובה הבאים.
   20 מ"מ DTT
   10 מ"מ BSA
   10 mM שמרים tRNAs
   חיץ 5X מחייב (50 מ"מ HEPES pH 8.0, 5 מ"מ EDTA, 250 מ"מ KCl, 0.2% Tween-20)
   100 פלואורסצין ננומטר שכותרתו RNA מסחרית
   חלבון Bicudal C מרוכז
   50% גליצרול ב DEPC שטופלו H ₂ O
   DEPC שטופלו H ₂ O
2. להרכיב את רכיבי התגובה מחייב צינור RNase חופשי microcentrifuge.
   1. כדי הצינור, להוסיף 5 μL של 10 מ"מ BSA, 5 μL של 20 מ"מ DTT, 5 μL של 10 mM שמרים tRNAs, 10 μL של הצפת 5x מחייב.
3. הוסף חלבון לריכוז סופי של 250 ננומטר ב 50 μL. הוסף מים לנפח סופי של 45 μL.
4. הוסף 5 μL של המצע RNA שכותרתו fluorescently. השתמש מסחרי שנרכש 3 'פלואורסצין שכותרתו 32 מצע נוקליאוטידים.
5. מערבבים ו דגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

3. ניתוח של דוגמאות על הילידים אופקית Polyacrylamide ג'ל

1. לכל תגובה, להוסיף 15 μL של גליצרול 50% ומערבבים בעדינות.
2. CarefuLly להוסיף 30 μL של כל תגובה לג'ל. כמות המדגם שניתן לטעון לתוך באר אחת משתנה בהתאם לעובי של ג 'ל ואת גודל הבארות. יש לנו כרכים טעון כמו μL 15 ו עד 45 μL לתוך באר אחת של ג'לים שנוצרו עם מסרק 24 גם שפכו לעובי של 2 ס"מ.
3. לאחר חיבור ספק הכוח למתג הג 'ל על הכוח ולהתאים את המתח. הפעל את הג'ל ב 4 ° C ב 120 V.
   הערה: עבור מכשיר ג'ל אופקית, זה בסופו של דבר להיות כ 5 V / cm. עבור מכשיר ג'ל אנכי, זה 16 V / cm.
   1. כדי למנוע נזק או הלבנה של RNA שכותרתו fluorescently, לנהל אלקטרופורזה בחושך.
   2. פעמים אלקטרופורזה משתנה בהתאם הפרטים של קומפלקס חלבון רנ"א להיות מנותח.
      הערה: יתרון גדול של ניתוח אופקי EMSA הוא אלקטרופורזה ניתן לעצור, הג'ל צילמו ולאחר מכן את geאני יכול להיות ממוקם בחזרה לתוך מנגנון אלקטרופורזה ניתן להמשיך עוד פעמים.

4. הדמיה ג'ל

1. בצע ניתוח עם כל מכשיר המיועד לזיהוי וצילום פלואורסצנטי הדמיה.
2. מניחים את הג'ל על imager.
3. התאם הגדרות imager. עבור ligands RNA fluorescein שכותרתו, השתמש בהגדרות הבאות: FAM (אורך גל 473 ננומטר), 750 מתח מכפיל (PMT), 100 פיקסלים פיקסל גודל.
4. סרוק את הג'ל כדי ללכוד תמונה.

תוצאות

כדי להדגים את הכוח ואת צדדיות של אופקי הילידים ג 'ל אלקטרופורזה ניתחנו את הכריכה של Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) חלבון ל RNA שכותרתו fluorescently המכיל אתר מחייב Bicc1. חלבונים Bicc1 לתפקד כמו mRNA ספציפיים מדכאים translational לשלוט בתאי הגורל החלטות במהלך השלבים האימהיים של ...

Discussion

ג 'ל polyacrylamide הילידים הם כלי רב ערך לחקר אינטראקציות חלבון- RNA ו באופן מסורתי ג'לים אלה electrophoresed אנכית ^{2 , 3} . השתמשנו שינוי של פרוטוקול מחליף ג 'ל polyacrylamide יליד נוצר electrophoresed אופקית ^{1 , 4 , 6<...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8