단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

요약

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용의 생화학 적 분석에 광범위하게 사용 되어온 분자 생물학의 기본 도구입니다. 이러한 상호 작용은 전통적으로 두 개의 유리판 사이에 생성 된 폴리 아크릴 아미드 젤과 수직으로 전기 영동 된 샘플로 분석되었습니다. 그러나, 폴리 아크릴 아미드 겔은 트레이에 캐스팅되고 수평으로 전기 영동 됨으로써 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어, 형광 RNA 기질과 특정 단백질 사이의 복합체를 분석하는 데 사용되는 수평 젤은 전기 영동이 진행됨에 따라 여러 번 이미지화 될 수 있습니다. 이것은 실험 중 여러 지점에서 RNA- 단백질 복합체를 모니터 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한, 수평 겔 전기 영동으로 많은 샘플을 동시에 분석 할 수 있습니다. 이것은 시간 경과 실험을 용이하게 할뿐만 아니라 여러 반응을 동시에 분석하여 여러 구성 요소와 조건을 비교할 수 있습니다. 여기에 우리가 홍보RNA-Protein 상호 작용을 분석하기 위해 수평 고유 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs)는 특정 단백질 - 핵산 상호 작용을 분석하는 귀중한 생화학 도구임이 입증되었습니다 ^{1 , 2 , 3} . 이 분석법은 핵산 - 단백질 복합체 ¹ 의 구성 화학 양롞 인 RNA 또는 DNA ³ 에 대한 단백질의 결합 친 화성에 관한 중요한 정보를 제공하며 기질 경쟁 실험 ^1을 통해 RNA 결합 단백질의 결합 특이성에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다 ¹ .

이 assays에 대한 전통적인 실험 설정은 정제 단백질과 방사성 표지 RNA 기판을 혼합하는 것으로 구성됩니다. 얻어진 복합체는 다음과 비 변성 분석 (네이티브) 폴리 아크릴 아미드 겔은 수직 장치 ^(3)에 시료 전기 영동 개의 유리판 사이에 붓고. 이 접근법은 핵산에 대한 단백질 결합의 기초가되는 생화학 적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하기 위해 철저하게 사용되었지만 몇 가지 한계점이 있습니다. 예를 들어,이 기본 전략은 상대적으로 처리량이 낮으며 여러 바인딩 반응을 병렬로 분석해야하는 응용 프로그램에는 쉽게 적용 할 수 없습니다. 또한 전통적인 수직 장치의 경우 전기 영동 중 여러 번 복합체를 모니터링하는 것이 어렵습니다 ^{3 , 4} .

여기에서는 평판 장치, 수평 전기 영동 및 형광 표지 된 RNA 기질 ^{4 , 5 , 6 , 7에} 주조 된 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하는 EMSA 분석의 적용을 제시합니다. 기본 스트레인에 대한 이러한 비교적 간단한 변형의 결합tegy는 몇 가지 강력한 이점을 제공합니다. 특히 수평 플랫 베드 형식은 수십 개의 샘플을 동시에 분석하는 데 적합합니다 ⁴ . 또한, Bicaudal-C 단백질과 RNA 기판 사이에 형성된 RNA- 단백질 복합체 (예 : 수평 겔에서 전기 영동)는 서로 다른 RNA- 단백질 복합체를 분해하고 이들을 미 결합 RNA 기질과 구별하는 능력이 향상되었습니다.

프로토콜

1. 수평 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔의 제조 ⁴ .

1. 필요한 재료 준비.
   1. 수평 겔 장치의 경우 27cm x 21cm 쟁반이있는 젤 상자 (37cm x 24cm)와 2 개의 24 웰 빗용 용량을 사용하십시오. 이 설정은 동시에 분석 할 수있는 총 48 개의 샘플을 제공합니다.
   2. 40 % Acrylamide-Bis 19 : 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED 및 10 % APS (ammonium persulfate) 시약을 준비하십시오.
2. 10 % 천연 아크릴 아마이드 젤 생성.
   1. 500 mL 플라스크에 5 x TBE 80 mL, 40 % 아크릴 아미드 100 mL 및 물을 넣어 최종 부피 400 mL로 만든다.
   2. 10 % APS 4 ML 및 TEMED 400 μL를 추가합니다. 잘 섞다.
   3. 수평 주조 트레이에 혼합물을 붓고 겔을 30 분 동안 중합시킵니다. 젤의 두께는 약 2cm입니다.
      참고 : 젤은 흄 후드에서 속도를 낼 수 있습니다.업 중합. 중합 반응 후 얇은 액체 층이 겔 위에 남습니다.
   4. 액체를 털어 내고 흐르는 완충액으로 헹구십시오. 조심스럽게 빗 (들)을 제거하고 주사기를 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어.
3. 실행 버퍼 준비.
   1. 겔 상자에 1x TBE 러닝 버퍼 2 L를 준비하십시오. 5XTBE 400 mL를 1600 mL로 희석하여 혼합한다. 차가운 방에 1x TBE 버퍼를 식힌다.
4. 젤 사전 가동
   1. 2L의 차가운 완충액을 젤 박스에 넣고 젤을 넣으십시오.
   2. 차가운 방에서 4 ° C에서 1 시간 120V에서 겔을 미리 실행하십시오. 이 시간 동안 결합 ​​반응을 준비하십시오.

2. 결합 반응 ⁸

1. 2.1. 다음 반응물을 준비하십시오.
   20 mM DTT
   10 mM BSA
   10 mM 효모 tRNA
   5X 결합 완충액 (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0.2 % Tween-20)
   상업적으로 구입 한 100 nM 형광 표지 RNA
   농축 된 Bicaudal-C 단백질
   DEPC 처리 된 H ₂ O에서 50 % 글리세롤
   DEPC 처리 된 H ₂ O
2. RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 바인딩 반응 구성 요소를 조립.
   1. 관에 10 mM BSA 5 μL, 20 mM DTT 5 μL, 10 mM 효모 tRNA 5 μL, 5x Binding Buffer 10 μL를 넣는다.
3. 50 μL에서 250 nM의 최종 농도로 단백질을 첨가하십시오. 45 μL의 최종 부피에 물을 넣으십시오.
4. 형광으로 표지 된 RNA 기질 5 μL를 첨가한다. 상업적으로 구입 한 3 'fluorescein으로 표지 된 32 개 뉴클레오타이드 기질을 사용하십시오.
5. 혼합하고 암실에서 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한다.

3. 네이티브 수평 폴리 아크릴 아미드 젤의 샘플 분석

1. 각 반응에 15 %의 50 % 글리세롤을 넣고 부드럽게 섞는다.
2. Carefu각 반응 30 μL를 젤에 첨가하십시오. 단일 웰에 적재 할 수있는 시료의 양은 겔의 두께와 웰의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 24-well 빗으로 생성 된 겔의 단일 웰에 15 μL와 45 μL의 부피를 적재하고 2 cm 두께로 쏟아 붓습니다.
3. 전원 공급 장치를 젤 장치 스위치에 연결 한 후 전압을 조정하십시오. 120 V에서 4 ° C에서 젤을 실행하십시오.
   참고 : 수평 겔 장치의 경우, 이는 약 5V / cm가됩니다. 수직 형 겔 장치의 경우, 이것은 16V / cm이다.
   1. 형광 표지 RNA의 손상이나 표백을 방지하려면 어둠 속에서 전기 영동을하십시오.
   2. 분석되는 RNA- 단백질 복합체의 특성에 따라 전기 영동 시간이 달라질 수 있습니다.
      참고 : 수평 EMSA 분석의 가장 큰 장점은 전기 영동을 멈추고 젤 이미지를 찍은 다음 gel은 장치에 다시 놓일 수 있고 전기 영동은 더 오랜 시간 동안 계속 될 수 있습니다.

4. 이미징 젤

1. 형광 물질 검출 및 이미징을 위해 설계된 모든 장비로 분석을 수행하십시오.
2. 이미 저에 젤을 올려 놓습니다.
3. 이미 저 설정을 조정하십시오. fluorescein-labeled RNA ligand의 경우, FAM (파장 473 nm), 750 Photomultiplier voltage (PMT), 100 μm 픽셀 크기의 세팅을 사용하십시오.
4. 젤을 스캔하여 이미지를 캡처하십시오.

결과

수평 네이티브 겔 전기 영동의 능력과 다양성을 입증하기 위해 우리는 Bicc1 결합 부위를 포함하는 형광 표지 된 RNA에 Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) 단백질의 결합을 분석했습니다. Bicc1 단백질 mRNA의 특정 리프레 병진 동물 개발 ^{9, 10, 11, 12의} 모체 단계뿐만 아니라 성인

토론

네이티브 폴리 아크릴 아마이드 젤은 단백질 -RNA 상호 작용을 조사하는 데 매우 중요한 도구이며 전통적으로이 젤은 수직으로 전기 영동됩니다 ^{2 , 3} . 우리는 생성 된 전기 폴리 아크릴 아마이드 젤을 대체하여 ^{1 , 4 , 6 , 7 , 15로} 전...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8