АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом для анализа взаимодействия РНК-белок. Традиционно в большинстве экспериментов использовались вертикальные гели. Однако горизонтальные гели обладают рядом преимуществ, таких как возможность мониторинга комплексов во время электрофореза. Мы предоставляем подробный протокол для генерации и использования горизонтального гель-электрофореза.

Аннотация

Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом молекулярной биологии, который широко используется для биохимического анализа взаимодействий РНК-белок. Эти взаимодействия традиционно анализировались полиакриламидными гелями, образованными между двумя стеклянными пластинами и образцами, электрофорезированными вертикально. Однако полиакриламидные гели, литые в лотках и электрофорезированные горизонтально, обладают несколькими преимуществами. Например, горизонтальные гели, используемые для анализа комплексов между флуоресцентными субстратами РНК и конкретными белками, могут быть отображены несколько раз по мере развития электрофореза. Это дает уникальную возможность контролировать РНК-белковые комплексы в нескольких точках во время эксперимента. Кроме того, горизонтальный гель-электрофорез позволяет параллельно анализировать многие образцы. Это может значительно облегчить эксперименты с временным курсом, а также одновременно проанализировать несколько реакций для сравнения различных компонентов и условий. Здесь мы имеемOvide подробный протокол для генерации и использования горизонтального нативного гель-электрофореза для анализа взаимодействия РНК-белок.

Введение

Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSAs) оказались бесценным биохимическим инструментом для анализа специфических взаимодействий белок-нуклеиновая кислота 1 , 2 , 3 . Эти анализы могут предоставить важную информацию о связывании сродства белков к РНК или ДНК 3 , стехиометрии компонентов нуклеиновых кислот-белковых комплексов 1 и дать важные новые сведения о специфичности связывания РНК-связывающих белков через субстратные конкурентные эксперименты 1 .

Традиционная экспериментальная установка для этих анализов состоит из смешивания очищенного белка с радиоактивно меченым РНК-субстратом. Полученные комплексы затем анализируют с помощью неденатурирующих (нативных) полиакриламидных гелей, вылитых между двумя стеклянными пластинами с последующим электрофорезом образца в вертикальном устройстве 3, Хотя этот подход был использован исчерпывающе, чтобы дать важные сведения о биохимических механизмах, которые лежат в основе связывания белков с нуклеиновыми кислотами, он также имеет несколько ограничений. Например, эта базовая стратегия имеет относительно низкую пропускную способность и не легко адаптируется для приложений, требующих параллельного анализа многих реакций связывания. Кроме того, с традиционным вертикальным аппаратом сложно потенциально контролировать комплексы в несколько раз во время электрофореза 3 , 4 .

Здесь мы представляем адаптацию анализа EMSA, в котором используются нативные полиакриламидные гели, литые в планшетном аппарате, горизонтальный электрофорез и флуоресцентно меченные РНК-субстраты 4 , 5 , 6 , 7 . Включение этих относительно простых модификаций в основную структуруTegy дает некоторые мощные преимущества. В частности, горизонтальная планшетный формат , который легко поддается анализу десятков образцов одновременно 4. Кроме того, для некоторых РНК-белковых комплексов, таких как те, которые образуются между белком Bicaudal-C и его электрофорезом в РНК-субстрате в горизонтальном геле, обеспечивается повышенная способность разрешать различные комплексы РНК-белок и отличить их от несвязанного РНК-субстрата.

протокол

1. Подготовка Горизонтального Нативного Полиакриламидного гел 4 .

  1. Подготовка необходимых материалов.
    1. Для горизонтального гелеобразного аппарата используйте гелевую коробку (37 см х 24 см) с поддоном 27 см х 21 см и емкость для двух 24-луночных гребней. Эта настройка обеспечивает в общей сложности 48 выборок, которые могут быть проанализированы одновременно.
    2. Приготовить следующие реагенты: 40% акриламид-бис 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED и 10% APS (персульфат аммония).
  2. Получение 10% активного акриламидного геля.
    1. В колбу на 500 мл добавьте 80 мл 5-кратного ТВЭ, 100 мл 40% акриламида и воду до конечного объема 400 мл.
    2. Добавить 4 мл 10% APS и 400 мкл TEMED. Хорошо перемешать.
    3. Вылейте смесь в горизонтальный литейный лоток и дайте гелю полимеризоваться в течение 30 мин. Гель будет иметь толщину приблизительно 2 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гели могут вставляться в вытяжной шкаф для ускоренияПолимеризации. После полимеризации тонкий слой жидкости останется на вершине геля.
    4. Вылейте жидкость и промойте бегущим буфером. Удалите гребенку (ы) тщательно и ополосните лунки бегущим буфером с помощью шприца.
  3. Подготовка бегущего буфера.
    1. Подготовьте 2 л 1x TBE-буфера для гелевой коробки. Разбавляют 400 мл 5XTBE 1600 мл и перемешивают. Поместите буфер 1x TBE в холодную комнату для охлаждения.
  4. Предварительная работа геля
    1. Добавьте 2 г холодного буфера в гелевую коробку и вставьте гель.
    2. Предварительно запустить гель при 120 В в течение 1 ч при 4 ° С в холодной комнате. В это время подготовьте реакцию связывания.

2. Связывающая реакция 8

  1. 2.1.Подготовьте следующие компоненты реакции.
    20 мМ DTT
    10 мМ BSA
    10 мМ дрожжевых тРНК
    5X (50 мМ HEPES pH 8,0, 5 мМ ЭДТА, 250 мМ KCl, 0,2% Твин-20)
    100 нМ флуоресцеиновой меченной РНК, приобретенной на коммерческой основе
    Концентрированный белок Bicaudal-C
    50% глицерина в обработанном DEPC H 2 O
    Обработанный DEPC H 2 O
  2. Соберите компоненты реакции связывания в бесконтактной микроцентрифужной пробирке, свободной от РНКазы.
    1. В пробирку добавьте 5 мкл 10 мМ BSA, 5 мкл 20 мМ DTT, 5 мкл 10 мМ дрожжей тРНК, 10 мкл 5x Binding Buffer.
  3. Добавить белок до конечной концентрации 250 нМ в 50 мкл. Добавьте воду до конечного объема 45 мкл.
  4. Добавьте 5 мкл флуоресцентно меченого РНК-субстрата. Используйте коммерчески приобретенный 3'-флуоресцеин, меченный 32-нуклеотидным субстратом.
  5. Смешать и инкубировать в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.

3. Анализ образцов на родном горизонтальном полиакриламидном геле

  1. Для каждой реакции добавьте 15 мкл 50% глицерина и осторожно перемешайте.
  2. сторожныДобавьте 30 мкл каждой реакции к гелю. Количество образца, которое может быть загружено в одну лунку, варьируется в зависимости от толщины геля и размера лунок. Мы загрузили объемы всего 15 мкл и до 45 мкл в одну лунку гелей, созданных с помощью 24-луночного гребня, и вылили до толщины 2 см.
  3. После подключения источника питания к гелевому устройству включите питание и настройте напряжение. Запустите гель при 4 ° C при 120 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для горизонтального гелеобразного аппарата это составляет примерно 5 В / см. Для вертикального гелеобразного аппарата это 16 В / см.
    1. Чтобы предотвратить повреждение или отбеливание флуоресцентно меченной РНК, проводите электрофорез в темноте.
    2. Время размораживания электрофореза в зависимости от специфики анализируемого комплекса РНК-белок.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Основным преимуществом горизонтального анализа EMSA является то, что электрофорез может быть остановлен, геля визуализированы, а затем geЛ можно поместить обратно в аппарат, и электрофорез можно продолжать в течение более длительного времени.

4. Изображение геля

  1. Проведите анализ с помощью любого инструмента, предназначенного для обнаружения и визуализации флуоресцентных субстратов.
  2. Поместите гель на тепловизор.
  3. Отрегулируйте настройки изображения. Для флуоресцеин-меченных РНК-лигандов используйте следующие настройки: FAM (длина волны 473 нм), 750 фотоумножителей (PMT), размер пикселя 100 мкм.
  4. Сканирование геля для захвата изображения.

Результаты

Чтобы продемонстрировать мощность и универсальность горизонтального гель-электрофореза, мы проанализировали связывание белка Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) с флуоресцентно меченной РНК, содержащей сайт связывания Bicc1. Белки Bicc1 функционируют в качестве мРНК-специфических тра...

Обсуждение

Родные полиакриламидные гели являются бесценным инструментом для исследования взаимодействия белок-РНК, и традиционно эти гели подвергают электрофорезу по вертикали 2 , 3 . Мы использовали модификацию протокола, который заменяет нативные полиакриламид...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Лауру Вандерплоэг за подготовку цифр. Работа в лаборатории Sheets поддерживается грантом NSF 1050395 и грантом NIH (R21HD076828). Работа в лаборатории Райдера поддерживается грантами NIH R01GM117237 и R01GM117008. Меган Доудл поддерживает стипендию SciMed GRS Advanced Opportunity через Университет Висконсин-Мэдисон и программу обучения биотехнологии через Национальный институт общих медицинских наук Национального института здоровья (T32GM008349).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Horizontal Gel BoxOWLN/AProduct no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combsOWLN/AProduct no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300Bio-Rad1655050
Mini-Protean II Electrophoresis CellBio-Rad165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/BisIBIIB70015
TEMEDIBIIB70120
APSIBIIB70080
Yeast tRNAsAmbionAM7119
Fluorescein labeled RNAIDTN/AOrder can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrateSigma-AldrichE5391-1KG
HEPESSigma-AldrichH4034-500G
Tris Base UltrapureUS BiologicalT8600
Boric AcidFisher ScientificBP168-500
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-1
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
DEPCSigma-Aldrich1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8

Ссылки

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Biochemistry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены