Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Özet

Doğal poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için temel bir araçtır. Geleneksel olarak çoğu deney dikey jel kullanmıştır. Bununla birlikte, yatay jeller elektroforez sırasında kompleksleri izleme fırsatı gibi birçok avantaj sağlar. Yatay doğal jel elektroforezinin üretilmesi ve kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Özet

Yerli poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerinin biyokimyasal analizi için kapsamlı bir şekilde kullanılan moleküler biyolojinin temel bir araçtır. Bu etkileşimler geleneksel olarak iki cam levha arasında üretilen poliakrilamid jelleri ve numuneler dikey olarak elektroforez ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, tepsilerde dökülen ve yatay olarak elektroforez edilen poliakrilamid jeller çeşitli avantajlar sunmaktadır. Örneğin, flüoresans RNA substratları ve spesifik proteinler arasındaki kompleksleri analiz etmek için kullanılan yatay jeller, elektroforez ilerledikçe birçok kez görüntülene edilebilir. Bu, deney sırasında RNA-protein komplekslerini çeşitli noktalarda izlemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, yatay jel elektroforezi birçok numuneyi paralel olarak analiz etmeyi mümkün kılar. Bu, farklı bileşenleri ve koşulları karşılaştırmak için zamanlama deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırabilir ve aynı anda birden fazla reaksiyonu analiz edebilir. İşte biz prRNA-Protein etkileşimlerini analiz etmek için yatay doğal jel elektroforezi üretmek ve kullanmak için ayrıntılı bir protokolü inceleyin.

Giriş

Elektroforetik mobilite kayma testleri (EMSA'lar), spesifik protein-nükleik asit etkileşimleri ^{1 , 2 , 3'ü} analiz etmek için paha biçilemez bir biyokimyasal araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahliller, proteinlerin RNA veya DNA ^3'e bağlanma afinitesi hakkında önemli bilgi sağlayabilir ve nükleik asit-protein komplekslerinin ¹ bileşen stokiyometrisi ¹ ve substrat rekabet deneyleri ¹ yoluyla RNA bağlama proteinlerinin bağlanma spesifitesi hakkında önemli yeni bilgiler sağlar ¹ .

Bu deneyler için geleneksel deney düzeneği, saflaştırılmış proteinin radyo-etiketli bir RNA substratı ile karıştırılmasından oluşur. Ortaya çıkan kompleksler daha sonra iki cam levha arasına dökülen denatüre edici olmayan (doğal) poliakrilamid jeller ile, ardından dikey bir cihazda ³ numune elektroforeziyle analiz edilir. Bu yaklaşım, proteinlerin nükleik asitlere bağlanmasının temelini oluşturan biyokimyasal mekanizmalarda önemli bilgiler sağlamak için kapsamlı bir şekilde kullanılmış olmakla birlikte, çeşitli sınırlamaları da vardır. Örneğin, bu temel strateji nispeten düşük işlem hacmine sahiptir ve birçok bağlama reaksiyonunu paralel olarak analiz etmeyi gerektiren uygulamalar için kolayca uyarlanamaz. Buna ek olarak, geleneksel dikey aparat ile elektroforez ^{3 , 4} sırasında kompleksleri birden çok kez potansiyel olarak izlemek zor.

Burada, düz yataklı bir aparatta, yatay elektroforezde ve floresanla etiketlenmiş RNA substratları ^{4 , 5 , 6 , 7'de} yerli poliakrilamid jelleri kullanan EMSA tahlilinin uyarlamasını sunuyoruz. Bu nispeten basit değişikliklerin temel samana dahil edilmesiTegy bazı güçlü avantajlar sağlar. Özellikle yatay masaüstü biçimi, düzinelerce numuneyi eşzamanlı olarak analiz etmeye yardımcı olur ⁴ . Ayrıca, Bicaudal-C proteini ile RNA substratı arasında oluşan RNA-protein kompleksleri için, yatay bir jelde elektroforez farklı RNA-protein komplekslerini çözmek ve bağlanmamış RNA substrattan ayırmak için artan bir yeteneğe sahiptir.

Protokol

1. Yatay Native Poliakrilamid Jelin Hazırlanması ⁴ .

1. Gerekli malzemelerin hazırlanması.
   1. Yatay jel aparatı için 27 cm x 21 cm'lik bir tepsi ve iki adet 24 kuyucuklu tarak için bir jel kutusu (37 cm x 24 cm) kullanın. Bu kurulum, aynı anda analiz edilebilecek toplam 48 örnek sağlar.
   2. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:% 40 Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8.0), TEMED ve% 10 APS (amonyum persülfat).
2. % 10 yerli akrilamid jelinin üretilmesi.
   1. 500 mL'lik bir şişe içerisinde 80 mL 5x TBE, 100 mL% 40 akrilamid ve su 400 mL'lik bir son hacme ilave edin.
   2. 4 mL% 10 APS ve 400 μL TEMED ekleyin. İyice karıştırın.
   3. Karışımı yatay döküm tepsisine dökün ve jelin 30 dakika boyunca polimerleşmesine izin verin. Jel yaklaşık 2 cm kalınlığında olacaktır.
      NOT: Jel hızlandırmak için bir duman kabına dökebilirUp polimerizasyon. Polimerizasyondan sonra, ince bir tabaka sıvı jelin üzerinde kalacaktır.
   4. Sıvıyı boşaltın ve akan tamponla durulayın. Tarakları dikkatlice çıkarın ve bir şırınga kullanarak oyuklu tamponla oyukları durulayın.
3. Çalışan tamponun hazırlanması.
   1. Jel kutusu için 2 L 1x TBE akış tamponu hazırlayın. 400 mL 5XTBE'yi 1600 mL ile inceltin ve karıştırın. Soğuk olması için 1x TBE tamponu soğuk odaya yerleştirin.
4. Jeli önceden çalıştırma
   1. Jel kutusuna 2 L soğuk çalıştıran tampon ekleyin ve jeli takın.
   2. Jeli, soğuk bir odada 4 ° C'de 1 saat 120 V'de önceden çalıştırın. Bu süre zarfında, bağlanma reaksiyonunu hazırlayın.

2. Bağlama Tepkisi ⁸

1. 2.1.Aşağıdaki reaksiyon bileşenlerini hazırlayın.
   20 mM DTT
   10 mM BSA
   10 mM maya tRNA'ları
   5X bağlama tamponu (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCI,% 0.2 Tween-20)
   Ticari olarak satın alınan 100 nM floresan etiketli RNA
   Konsantre Bikioz-C proteini
   DEPC ile muamele edilmiş, _H2O içinde% 50 gliserol
   DEPC ile muamele edilmiş _H2O
2. Bağlanma reaksiyon bileşenlerini bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin.
   1. Tüp için, 10 mM BSA 5 mcL, 20 mM DTT 5 mcL, 10 mM maya tRNA'lar 5 mcL, 5 x Cilt Tamponu 10 mcL ekleyin.
3. 50 uL'de 250 nM son konsantrasyona protein ekleyin. 45 μL'lik nihai bir hacme su ilave edin.
4. 5 μL floresanla işaretlenmiş RNA substratı ekleyin. Ticari olarak satın alınan bir 3 'fluorescein etiketli 32-nukleotid substrat kullanın.
5. Karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

3. Yerli Yatay Poliakrilamid Jelinde Numunelerin Analizi

1. Her tepkime için, 15 μL% 50 gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın.
2. dikkatli bir şekildJellere her reaksiyondan 30 μL ekleyin. Tek bir oyuğa yüklenebilecek numune miktarı, jelin kalınlığına ve oyukların boyutuna bağlı olarak değişir. 24-kuyucuklu bir tarakla yaratılan ve 2 cm'lik bir kalınlığa dökülen tek bir jel jeline 15 μL kadar ve 45 μL kadar hacim yükledik.
3. Gç kaynağını jel aparatına bağladıktan sonra güç kaynağını açın ve voltajı ayarlayın. Jel 4 ° C'de 120 V'de çalıştırın.
   NOT: Yatay jel aparatı için yaklaşık 5 V / cm kalır. Dikey jel aparatı için, bu 16 V / cm'dir.
   1. Floresanla işaretlenmiş RNA'nın hasar görmesini veya ağartılmasını önlemek için karanlıkta elektroforez yapın.
   2. Analiz edilen RNA-protein kompleksinin özelliklerine bağlı olarak değişen elektroforez zamanı.
      NOT: Yatay EMSA analizinin önemli bir avantajı, elektroforezin durdurulabileceği, jelin görüntülendiği ve daha sonra daCihaza tekrar yerleştirilebilir ve elektroforez daha uzun süre devam edebilir.

4. Jel Görüntüleme

1. Floresan yüzeyler algılama ve görüntüleme için tasarlanmış herhangi bir enstrüman ile analiz yapın.
2. Jeli görüntüleyiciye yerleştirin.
3. Görüntüleyici ayarlarını yapın. Floresein etiketli RNA ligandları için aşağıdaki ayarları kullanın: FAM (dalga boyu 473 nm), 750 Fotomultiplier voltaj (PMT), 100 μm piksel boyutu.
4. Görüntü yakalamak için jel tarayın.

Sonuçlar

Yatay doğal jel elektroforezinin gücü ve çok yönlülüğünü göstermek için Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) proteininin bir Bicc1 bağlanma yeri içeren floresanla işaretlenmiş bir RNA'ya bağlandığını analiz ettik. Bicc1 proteinleri, hayvanlarda gelişme ^{9 , 10 , 11 , 12'nin} maternal evreleri boyunca hücre akıbeti kararlarını kont...

Tartışmalar

Yerli poliakrilamid jelleri, protein-RNA etkileşimlerini araştırmak için paha biçilemez bir araçtır ve geleneksel olarak bu jeller dikey olarak ^{2 , 3} elektroforez edilir. Doğal poliakrilamid jelleri oluşturan ve yatay olarak elektroforez edilen ^{1 , 4 , 6 , 7 , 15'in} yerini alan bir protok...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8