Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Zusammenfassung

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Instrument zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Traditionell haben die meisten Experimente vertikale Gele verwendet. Jedoch bieten horizontale Gele mehrere Vorteile, wie die Möglichkeit, Komplexe während der Elektrophorese zu überwachen. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Verfügung.

Zusammenfassung

Die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Werkzeug der Molekularbiologie, das ausgiebig für die biochemische Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde. Diese Wechselwirkungen wurden traditionell mit Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten und Proben hergestellt wurden, die vertikal elektrophoretisch wurden. Allerdings bieten Polyacrylamidgele, die in Tabletts gegossen und horizontal elektrophoresiert werden, mehrere Vorteile. Zum Beispiel können horizontale Gele, die verwendet werden, um Komplexe zwischen fluoreszierenden RNA-Substraten und spezifischen Proteinen zu analysieren, mehrfach abgebildet werden, wenn die Elektrophorese fortschreitet. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, RNA-Protein-Komplexe an mehreren Punkten während des Experiments zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht die horizontale Gelelektrophorese, mehrere Proben parallel zu analysieren. Dies erleichtert die zeitlichen Verlaufsexperimente und analysiert gleichzeitig mehrere Reaktionen, um verschiedene Komponenten und Bedingungen miteinander zu vergleichen. Hier sind wir prOvide ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen.

Einleitung

Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSAs) haben sich als ein unschätzbares biochemisches Instrument erwiesen, um spezifische Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ^{1 , 2 , 3} zu analysieren. Diese Assays können wichtige Informationen in Bezug auf die Bindungsaffinität von Proteinen an RNA oder DNA ^3, die Komponente Stöchiometrie von Nukleinsäure-Protein - Komplexe ¹ und liefern wichtige neue Erkenntnisse über die Bindungsspezifität der RNA - Bindeproteine via Substrat Kompetitionsexperimente ^1.

Der traditionelle experimentelle Aufbau für diese Assays besteht darin, gereinigtes Protein mit einem radioaktiv markierten RNA-Substrat zu mischen. Die resultierenden Komplexe werden dann mit nicht denaturierenden (nativen) Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten gefolgt von einer Probenelektrophorese in einer vertikalen Vorrichtung ³ gegossen werden. Während dieser Ansatz erschöpfend genutzt wurde, um wichtige Einblicke in die biochemischen Mechanismen zu liefern, die der Bindung von Proteinen an Nukleinsäuren zugrunde liegen, hat sie auch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel hat diese Grundstrategie einen relativ geringen Durchsatz und ist für Anwendungen, die viele analoge Bindungsreaktionen parallel analysieren, nicht leicht anpassbar. Darüber hinaus ist es bei der traditionellen vertikalen Apparatur schwierig, die Komplexe während der Elektrophorese ^{3 , 4} mehrfach zu überwachen.

Hier stellen wir eine Adaption des EMSA-Assays vor, der native Polyacrylamidgele verwendet, die in eine Flachbettapparatur, horizontale Elektrophorese und fluoreszenzmarkierte RNA-Substrate ^{4 , 5 , 6 , 7} gegossen werden. Die Einarbeitung dieser relativ einfachen Modifikationen an die Basis-StrTegy bietet einige mächtige Vorteile. Insbesondere das horizontale Flachbettformat eignet sich leicht zur gleichzeitigen Analyse von Dutzenden von Proben ⁴ . Auch für einige RNA-Proteinkomplexe, wie jene, die zwischen dem Bicaudal-C-Protein und seiner RNA-Substrat-Elektrophorese in einem horizontalen Gel gebildet werden, ergibt sich eine erhöhte Fähigkeit, unterschiedliche RNA-Protein-Komplexe aufzulösen und diese aus dem ungebundenen RNA-Substrat zu unterscheiden.

Protokoll

1. Herstellung des horizontalen nativen Polyacrylamidgels ⁴ .

1. Vorbereitung der benötigten Materialien.
   1. Für die horizontale Gel-Apparatur verwenden Sie eine Gel-Box (37 cm x 24 cm) mit einem 27 cm x 21 cm Tablett und eine Kapazität für zwei 24-Well-Kämme. Dieses Setup bietet insgesamt 48 Samples, die gleichzeitig analysiert werden können.
   2. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor: 40% Acrylamid-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8,0), TEMED und 10% APS (Ammoniumpersulfat).
2. Erzeugung eines 10% nativen Acrylamidgels
   1. In einem 500 ml-Kolben werden 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% Acrylamid und Wasser auf ein Endvolumen von 400 ml gegeben.
   2. Fügen Sie 4 ml 10% APS und 400 μl TEMED hinzu. Gut mischen.
   3. Gießen Sie die Mischung in die horizontale Gießschale und lassen Sie das Gel für 30 min zu polymerisieren. Das Gel wird etwa 2 cm dick.
      HINWEIS: Gele können in eine Dunstabzugshaube werfenUp-Polymerisation. Nach der Polymerisation bleibt eine dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Gel.
   4. Gießen Sie die Flüssigkeit aus und spülen Sie mit Laufpuffer. Entfernen Sie den Kamm (s) sorgfältig und spülen Sie die Brunnen mit Laufpuffer mit einer Spritze.
3. Vorbereitung des laufenden Puffers
   1. Vorbereitung 2 L von 1x TBE Laufpuffer für die Gelbox. 400 ml 5XTBE mit 1600 ml verdünnen und mischen. Legen Sie 1x TBE Puffer in kalten Raum zu kühlen.
4. Vorlauf des Gels
   1. Füge 2 L des kalten Laufpuffers zum Gelkasten hinzu und lege das Gel ein.
   2. Vorbereiten des Gels bei 120 V für 1 h bei 4 ° C in einem kalten Raum. Während dieser Zeit die Bindungsreaktion vorbereiten.

2. Bindungsreaktion ⁸

1. 2.1.Prepare die folgenden Reaktionskomponenten.
   20 mM DTT
   10 mM BSA
   10 mM Hefe-tRNAs
   5X Bindungspuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
   100 nM Fluorescein-markierte RNA, die kommerziell gekauft wurde
   Konzentriertes Bicaudal-C-Protein
   50% Glycerin in DEPC-behandeltem H ₂ O
   DEPC-behandeltes H ₂ O
2. Montieren Sie die Bindungsreaktionskomponenten in einem RNase-freien Mikrozentrifugenröhrchen.
   1. Zu dem Röhrchen werden 5 & mgr; l 10 mM BSA, 5 & mgr; l 20 mM DTT, 5 & mgr; l 10 mM Hefe-tRNAs, 10 & mgr; l 5x Bindungspuffer gegeben.
3. Füge Protein zu einer Endkonzentration von 250 nM in 50 μl hinzu. Füge Wasser zu einem Endvolumen von 45 μl hinzu.
4. Füge 5 μl fluoreszenzmarkiertes RNA-Substrat hinzu. Verwenden Sie ein handelsübliches 3'-Fluorescein-markiertes 32-Nukleotidsubstrat.
5. Mischen und inkubieren im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur.

3. Analyse der Proben auf dem nativen horizontalen Polyacrylamidgel

1. Zu jeder Reaktion werden 15 μl 50% Glycerin gegeben und vorsichtig vermischt.
2. PflegeLly addieren 30 & mgr; l jeder Reaktion auf das Gel. Die Menge der Probe, die in eine einzige Vertiefung geladen werden kann, variiert in Abhängigkeit von der Dicke des Gels und der Größe der Vertiefungen. Wir haben Volumina bis zu 15 μl und bis zu 45 μl in eine einzige Bohrung mit einem 24-Well-Kamm geladen und auf eine Dicke von 2 cm gegossen.
3. Nach dem Anschließen der Stromversorgung an die Gel-Gerät schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie die Spannung. Führen Sie das Gel in 4 ° C bei 120 V.
   HINWEIS: Für die horizontale Gel-Apparatur liegt damit etwa 5 V / cm. Für die vertikale Gelapparatur beträgt das 16 V / cm.
   1. Um eine Beschädigung oder Bleichung der fluoreszenzmarkierten RNA zu verhindern, führen Sie die Elektrophorese im Dunkeln durch.
   2. Phary-Elektrophorese-Zeiten in Abhängigkeit von den Besonderheiten des zu analysierenden RNA-Protein-Komplexes.
      HINWEIS: Ein großer Vorteil der horizontalen EMSA-Analyse ist, dass die Elektrophorese gestoppt werden kann, das Gel abgebildet und dann die geL kann in den Apparat zurückgestellt werden und die Elektrophorese kann für längere Zeit fortgesetzt werden.

4. Imaging der Gel

1. Führen Sie die Analyse mit jedem Instrument für die Erkennung und Bildgebung fluoreszierende Substrate.
2. Lege das Gel auf den Imager.
3. Anpassungseinstellungen einstellen Für Fluorescein-markierte RNA-Liganden verwenden Sie folgende Einstellungen: FAM (Wellenlänge 473 nm), 750 Photovervielfacherspannung (PMT), 100 μm Pixelgröße.
4. Scannen Sie das Gel, um das Bild zu erfassen.

Ergebnisse

Um die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der horizontalen nativen Gelelektrophorese zu demonstrieren, analysierten wir die Bindung des Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) Proteins an eine fluoreszenzmarkierte RNA, die eine Bicc1-Bindungsstelle enthielt. Bicc1-Proteine ​​fungieren als mRNA-spezifische Translationsrepressoren zur Kontrolle der Zellschicksalentscheidungen während der mütterlichen Stadien der Tierentwicklung ^{9 ,}

Diskussion

Native Polyacrylamidgele sind ein unschätzbares Hilfsmittel zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen und traditionell werden diese Gele vertikal ^{2 , 3} elektrophoresiert. Wir haben eine Modifikation des Protokolls verwendet, das native Polyacrylamidgele ersetzt, die horizontal hergestellt und elektrophoresiert werden ^{1 , 4 , 6 , 7}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs	OWL	N/A	Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein labeled RNA	IDT	N/A	Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boric Acid	Fisher Scientific	BP168-500
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8