粘附细胞培养的时间推移荧光显微镜对蛋白质降解率的单细胞定量研究

摘要

该协议描述了一种方法, 以确定蛋白质半生命的单一生活粘附细胞, 使用脉冲标记和荧光时间推移成像的捕捉标签融合蛋白。

摘要

蛋白质处于合成和降解的动态状态, 它们的半衰期可以在各种情况下进行调节。然而, 最常用的测定蛋白质半衰期的方法要么仅限于裂解细胞的总体平均值, 要么需要使用蛋白质合成抑制剂。该协议描述了一种方法来测量蛋白质半衰期在单一的生活粘附细胞, 使用捕捉标签融合蛋白结合荧光时间推移显微镜。任何有兴趣的蛋白质都可以通过与 benzylguanine 衍生物结合的荧光、细胞渗透染料与一个标签的共价键结合, 并且在残留染料被冲蚀后可以对标记蛋白的衰变进行监测。随着时间的推移, 细胞的跟踪和综合荧光强度的量化导致了每个跟踪细胞的指数衰减曲线, 从而可以通过曲线拟合确定单个细胞的蛋白质降解率。这种方法为培养细胞中半生命体的异质性提供了一个估计, 这是不能用其他方法来评估的。这里提出的方法适用于任何类型的培养粘附细胞表达的兴趣蛋白融合到一个 SNAP 标签。在这里, 我们使用小鼠胚胎干细胞生长在 e-钙黏附素涂层细胞培养板, 以说明如何单细胞降解率的蛋白质与广泛的半衰期可以确定。

引言

众所周知, 细胞蛋白具有广泛的周转, 合成和降解率是特定的每个蛋白质和受生理调节。传统上, 蛋白质降解率已被测量使用散装方法, 如放射性脉冲追逐分析, 或涉及蛋白质合成抑制剂, 如放线菌¹。最近, 与质谱联用的细胞培养 (SILAC) 中的氨基酸的稳定同位素标记已经建立, 以在全球范围内量化蛋白质周转量²。但是, 这些方法受人口平均的限制, 因此, 关于细胞间可变性的信息就会丢失。此外, 无法确定在整个细胞中不同步的蛋白质降解的瞬态变化。

另外, 蛋白质半衰期也可以通过荧光的方法来确定, 这通常具有提供单细胞分辨率的优点。例如, 一个 photoactivatable 的绿色荧光蛋白 (paGFP) 已经被用来确定早期哺乳动物胚胎中的 Oct4 半衰期³。另一种监测活细胞中蛋白质衰变的方法是使用捕捉标记与荧光延时成像相结合。SNAP 标签是一个变种版本的 dna 修复酶 O⁶-alkylguanine dna-alkyltransferase (AGT), 特别是与 benzylguanine (BG) 衍生物, 这可以耦合到分子探针^4,5,6. 因此, 任何捕捉标签的融合蛋白都可以用荧光、细胞渗透染料进行不可逆转的标记。脉冲标记的兴趣蛋白融合到 SNAP 标签, 其次是残留染料的冲洗, 允许监测的标记蛋白的人口的退化, 从而确定蛋白质半生命。SNAP 标签已成功地用于蛋白质的脉冲追逐标记和确定蛋白半生命的黏附细胞培养和在体内^5,7,8,9。在商业上有大量的对齐标签衬底覆盖常用的荧光光谱, 使每个特定应用的最佳染料的选择。因此, SNAP 标签也可以用于多色成像结合其他荧光融合蛋白或染料。细胞不渗透性染料适用于膜栓蛋白的标记, 而细胞通透性染料则适用于细胞内和膜结合蛋白的监测。此外, 这些探针中的一些几乎没有基本的荧光, 只有在绑定到 SNAP 标记¹⁰时才开始发出强烈的荧光信号。

本协议描述了如何使用 SNAP 标签测量单个细胞中不同蛋白质的降解率。我们将这种方法应用于小鼠胚胎干细胞培养的 e-钙黏蛋白, 但它应该有可能使用它与任何黏附培养的细胞类型。我们表明, 脉冲标记的快照标签融合蛋白, 其次是荧光时间推移成像, 允许确定的单个细胞半衰期的各种蛋白质的兴趣, 并提供了一个估计的细胞变化的一半生命在培养细胞的数量。

研究方案

注: 本研究采用 E14 ES 细胞系。然而, 该协议直接适用于任何其他的小鼠 ES 细胞系, 表达一种与 SNAP 标签融合的感兴趣的蛋白质, 或者通过标记内源蛋白或使用过度表现。在结果部分所示的例子中, 使用了强力霉素-诱导的 snap 标记融合细胞系 (snap 标记融合到以下蛋白质: Nanog, Oct4, Srsf11, 或对荧光蛋白 mOrange2 和 sfGFP, 并置于控制下强力霉素诱导的启动子。有关用于生成强力霉素诱导的 SNAP 标记融合细胞系的质粒的进一步信息, 请参见¹¹ 。强力霉素诱导的系统可以特别有用, 因为它能够严格控制的时间和强度的表达的蛋白质的利益。建议采用 c-终端定位, 因为改变 n 端氨基酸序列更有可能改变目标蛋白的半衰期 (n 端规则¹²)。

1. e-钙黏附素涂层和细胞播种

1. 生成一个 ES 单元格线, 表示与快照标记⁴融合的感兴趣的蛋白质。
2. 100毫米细胞培养皿4毫升0.1% 明胶 (稀释磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 没有 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}) 为 1 h. 除去明胶, 让干燥 1 h. 立即使用或将涂覆的盘子储存多达2月。
3. 培养 es 细胞培养基中的细胞系 (格拉斯哥最低必需培养基, 辅以 10% es 细胞合格胎牛血清, 2 毫米丙酮酸钠, 1% 非必需氨基酸, 1% 青霉素/链霉素, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 100 µM 2-基, 白血病抑制因子 (LIF), 3 µM CHIR99021 和0.8 µM PD184352) 在明胶涂层的菜肴在37° c 和 5% CO₂ 2 天, 直到到达一个汇合 10-20 的宇达细胞每道菜。
   注意: 在这里, LIF 是由 HEK 293T 细胞的瞬态转染产生的, 其次是上清收集和过滤。每批 LIF 测试的潜力, 以保持多, 但浓度没有确定。然而, 重组 LIF 也可以在商业上使用, 并且通常用于小鼠 ES 细胞培养的浓度是1000单位/毫升¹³。
4. 外套一个96井板适合成像与30µL 重组小鼠 e-钙黏蛋白 fc 嵌合体蛋白质 (e-cad-fc) 每井 (5 ng/µL, 稀释在 PBS 与 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}。使用库存浓度 100 ng/µL, 储存在-80 ° c)。避免广泛的移, 因为电子 cad Fc 是非常脆弱的。孵育在37° c 为1.5 小时。
   注: 视显微镜而定, 可使用其他格式。
5. 吸气电子 cad Fc, 用100µL 的 PBS 与 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}, 并添加100µL 预热 ES 细胞培养基。
6. 用5毫升 PBS 清洗感兴趣的细胞而不需要 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}。吸气并加入2毫升的胰蛋白酶-EDTA 0.25%。孵育4分钟, 在37° c。添加4毫升 es 细胞培养基, 重和旋转 1000 x g, 4 分钟, 在2毫升的新鲜 es 细胞培养基中吸取上清和重颗粒。
   注: 不含 ca^{2 +}/Mg^{2 +}的 PBS 应用于在 trypsinization 之前清洗单元格, 以删除 ca^{2 +}离子, 这是细胞黏附所必需的。相比之下, 对于 e cad fc 稀释和涂层 (步骤 1.4), 使用 PBS 与 ca^{2 +}/Mg^{2 +}, 因为 ES 细胞与 e-cad-fc 涂覆的盘子的黏附力是 ca^{2 +}依赖¹⁴。
7. 在 ES 细胞培养基的1毫升中稀释悬浮细胞 1:10, 使用计数室 (载荷10µL 为 0.1 mm 深度的腔)。
8. 种子3万细胞/cm²在电子 cad-Fc 涂层成像板。用 ES 细胞培养基填充200µL。对于强力霉素诱导的细胞系, 诱导与适当剂量强力霉素 (优化剂量和时间诱导提前。在这里使用的细胞系治疗 500 ng/毫升强力霉素24小时前成像)。孵育在37° c 和 5% CO₂ , 并进行脉冲标记和成像24小时后, 细胞播种。

2. 标签的脉冲标记

注意: 对于蛋白质衰变实验来说, 使用适当的染料浓度是至关重要的。浓度应足够高, 以产生一个明亮的信号, 在开始时的时间推移, 因为荧光将减少随着时间的推移。然而, 使用太高的染料浓度可能会导致残留染料留在培养基或在细胞中, 即使在洗涤后。在电影的过程中, 游离染料可能会绑定到新产生的 SNAP 标记分子, 这将扭曲衰变曲线。所观察到的荧光信号将取决于染料的性质、所使用的细胞线以及相应蛋白质的表达水平。因此, 通过测试不同的稀释, 从制造商对活细胞成像的稀释建议开始, 对染料浓度进行优化是至关重要的。本研究采用了一种远红光荧光基板。测定了强力霉素诱导的过度表达细胞株的 12 nM 的最佳浓度。

1. 在预热 ES 细胞培养基中, 将该染料稀释到适当浓度。使用吸管轻轻地从先前在96井板上播种的细胞中去除培养基, 并在每个井中添加50µL 的稀释的对齐染料。孵育30分钟, 在37° c。
2. 用吸管吸去稀释后的染料, 用200µL 预热 PBS (不含 Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) 洗涤3x。添加200µL ES 细胞培养基, 孵育15分钟, 在37° c。
3. 重复前面的洗涤步骤两次以上。
   注: 为了去除任何未粘合的染料, 广泛的洗涤是重要的。重复洗涤步骤与 PBS 去除残留的胞外染料在培养基中, 而15分钟孵化确保在开始成像实验之前, 对捕捉标签融合蛋白的鲁棒标记。然而, 通过温和的移来执行洗涤步骤, 不要使用自动器, 因为在电子 cad Fc 上播种的细胞倾向于容易分离。
4. 添加200µL 成像介质。为减少荧光背景, 使用酚红游离培养基 (辅以 10% ES 细胞合格胎牛血清, 2 毫米丙酮酸钠, 1% 非必需氨基酸, 1% 青霉素/链霉素, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 100 µM 2-基, LIF, 3 µMCHIR99021 和0.8 µM PD184352)。

3. 延时显微镜

1. 使用适合实时成像的显微镜, 允许控制温度和 CO₂。将温度设置为37° c, CO₂到5% 之前使用, 并允许平衡为 1-2 h。
2. 把盘子放到显微镜下, 找到适合于成像的斑点。选择那些单元格分布均匀但不太密集的斑点, 这将有助于分析。将所选点的数目调整为分析所需的单元格数。在这项研究中, 每细胞线记录 3-5 点。
3. 选择目标。20X 目标适合 ES 细胞的大小。
4. 选择要记录的荧光通道的光照设置。根据感兴趣细胞的荧光信号强度调整激光功率和曝光率。确保获得一个强大的初始信号, 因为它会减少在电影的过程中, 但避免激光功率高于 30%, 以尽量减少光和漂白。本研究采用 632/22 nm (波长/带通) 的励磁滤波器、679/34 nm (波长/带通) 的发射滤波器、10% 的激光功率和 100 ms 的曝光时间。
5. 选择时间推移实验的成像间隔和周期。对于预期半衰期为 2-20 小时的蛋白质, 选择 12-24 h 的捕获时间, 间隔为15分钟。为更短的居住的蛋白质, 减少间隔时间和承购时间, 为更长的居住的蛋白质相应地增加。
6. 开始成像。

4. 图像处理与分析

1. 以 tiff 格式将获取的图像作为堆栈收集。要进行进一步的处理和分析, 请使用斐济软件¹⁵。如果显微镜软件未将时间间隔数据收集成堆栈, 请在软件中打开时间推移实验的所有帧 (通过单击文件|打开...或将相应的文件拖放到工具栏上), 然后单击图像|堆栈|要堆叠的图像。
2. 使用减法背景函数从堆栈中的所有图片中删除背景。为此, 请单击进程|减去背景。在弹出窗口中选择滚动球半径。使用的半径至少是所成像单元格的大小。若要将背景减法应用于堆栈中的所有单元格, 请在 "进程堆栈" 弹出窗口中选择是。
3. 选择一个感兴趣的单元格, 并使用工具栏在它周围绘制一个感兴趣的区域 (ROI)。对于核信号, 使用椭圆形选择, 首先单击工具栏中相应的选项卡, 然后单击感兴趣的核心并调整其周围的椭圆。对于细胞质信号或非常密集的区域使用徒手选择可以密切遵循细胞轮廓。避免包含太大的背景区域, 即使没有必要精确地跟踪单元格的轮廓, 因为所有背景像素的后续减法 (步骤 4.8-4.9)。
4. 通过单击分析 |工具 |投资回报率经理 |在键盘上添加或按T 。
5. 通过在 "堆栈" 窗口中移动选项卡, 或按键盘上的 "shift + <", 然后重复前面的操作, 继续到下一帧。在整个电影过程中跟踪感兴趣的单元格, 并将每个帧的 roi 添加到 roi 管理器中。单击其他| 保存每个跟踪单元格的最终 ROI 集在 ROI 管理器中保存..。
   注意: 在细胞分裂之后, 分开地跟踪两个子细胞并且在背景减法之后总结他们的综合强度 (参见步骤 4.6-4.9) 在细胞分裂期间考虑蛋白质稀释。保存两个子单元格的 ROI 集。
6. 在整个影片中跟踪感兴趣的单元格后, 单击度量, 以获取平均强度和 roi 区域的值。将获得的值复制到电子电子表格程序中, 并计算每个时间点的单元格的原始集成强度, 如下所示:
   
   其中平均值_c是平均强度和区域_c相应 ROI 的区域。
7. 若要估计本地背景, 请在每个时间框架的感兴趣的单元格附近添加一个 ROI。避免包括任何细胞荧光信号。使用一个近似于单元格大小的循环 ROI, 如果需要, 可以相应地移动或收缩它,例如如果相邻的单元格干扰。按照前面所述的蜂窝 roi 集进行操作, 以便获得背景 roi 集并将测量的强度值复制到电子表格中。
8. 为了获得对单元格的综合强度的背景校正值, 首先计算每个时间点的背景的综合强度:
   
   其中平均值_BG 是背景信号的平均强度,区域_C 是环绕单元格的 ROI 区域。不要使用背景 ROI 区域, 除非两个区域的大小相同。
9. 计算每个时间点的单元格的最终背景减去集成强度:
   
10. 为了使单个细胞衰变曲线正常化, 将每个时间点的强度值除以第一个时间点的强度值。
    注意: 曲线拟合 (参见步骤 4.11) 可以在每个单个单元格上执行, 也可在总体平均值上进行。如果计算基于总体的平均值以避免细胞间不同荧光强度的偏差, 则需要进行规范化。因此, 正常化确保每个单元对最终衰变曲线具有相同的权重。此外, 规范化可以很有用地可视化单个细胞衰变, 独立于其绝对荧光强度 (参见图 3 a-3 c)。但是, 如果只确定单单元半寿命, 且数据不平均, 则可以省略规范化步骤, 并可直接对原始数据执行曲线拟合。
11. 对于蛋白质半衰期的估计, 使用曲线拟合工具。在这项研究中, 使用了 matlab 曲线拟合工具箱 3.4.1, 它位于 matlab 用户界面的应用程序部分的默认位置。通过单击导入数据选项卡, 将电子表格中的荧光强度和时间值导入到 MATLAB 中. 打开 "曲线拟合工具箱", 然后在X 数据和Y 中选择时间点和荧光衰减数据数据选项卡. 选择自定义公式在 "曲线拟合" 选项卡中, 输入指数衰减的公式:
    
    其中, f (t)是给定时间点的荧光强度, a初始强度和b衰变率。在适应选项... 选项卡中, 为a和b的下限选择0。然后, a和b的估计值将显示在结果窗口中。计算半寿命如下:
    

结果

所描述的协议提供了一个估计的细胞的可变性在半衰期的任何给定的蛋白质融合到一个 SNAP 标签。使用重组 e-钙黏附素-Fc 用于涂层的成像板允许单细胞分辨率在 ES 细胞, 否则生长在殖民地。可以在整个影片过程中单独跟踪单个单元格 (图 1A)。

为了确定每个单细胞的蛋白质半衰期, 重要的是要测量的集成, 背景扣除的 SNAP 标签荧光信号随着时间的推移 (

讨论

当使用 SNAP 标签来监测蛋白质衰变时, 最关键的一步是确保在培养基中或在洗涤后的细胞中没有残留的未粘合染料, 否则它可能在实验过程中与新产生的 SNAP 标签分子结合在一起。伊破坏衰变曲线。这是一方面通过仔细执行所有描述的洗涤步骤实现的。另一方面, 染料的浓度应该保持尽可能低, 而仍然在一个范围, 允许获得一个良好的信噪比。如图 2所示, 应通过测试不同的稀?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest	-	-
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Corning	353003
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate	Corning	353219
Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm	Marienfeld-superior	640030
CO2 Incubator	Panasonic	MCO-170AICUV-PE
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5804000528
InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System	GE Healthcare Life Sciences	29027886
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	G5154
Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified	ThermoFisher	16141-079
Sodium pyruvate solution	Sigma-Aldrich	113-24-6
Minimum Essential Medium  Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140-035
Penicillin-Streptomycin	BioConcept	4-01F00H
L-Glutamine 200mM	ThermoFisher	25030-024
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689-25ML-F
Leukemia Inhibitory factor	-	-	Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.
CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)	Merck Millipore	361559
PD 0325901	Sigma-Aldrich	391210-10-9
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Dulbecco's PBS 10x concentrated	BioConcept	3-05K00-I
Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++	BioConcept	3-05F29-I
Trypsin-EDTA-Solution 0.25%	Sigma-Aldrich	T4049
Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein	R&D systems	748-EC-050
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
SNAP-Cell 647-SiR	New England BioLabs	S9102S
FluoroBrite DMEM	ThermoFisher	A18967-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
FIJI	-	-	Open-source image analysis software
MATLAB R2014a	Mathworks	-
Microsoft Excel	Microsoft	-