脊髓损伤后压力溃疡的小鼠模型

摘要

在这里, 我们描述了一个简单的方法, 以诱导临床相关的皮肤压疮 (pu) 在小鼠模型的脊髓损伤 (sci)。该模型可用于临床前的研究, 筛选不同的治疗方法治疗 pu 在 sci 患者。

摘要

压疮 (pu) 是外伤性脊髓损伤 (sci) 常见的衰弱并发症, 往往发生在骨性突起周围的软组织中。然而, 在受控实验环境中, 在动物模型的背景下, sci 对皮肤伤口愈合的影响鲜为人知。在本研究中, 提出了一种简单、非侵入性、可重复性和临床相关的全 sci 背景下的小鼠 pu 模型。成年雄性小鼠 (巴布克, 10周大) 被剃光并脱毛。脱毛后 (24小时), 小鼠接受椎板切除术, 然后进行完整的脊髓横断 (t9-t10 椎骨)。紧接着, 小鼠背部的皮肤褶皱被抬起, 夹在两个磁碟之间, 在接下来的12小时内, 从而形成了一个缺血区域, 在随后的几天里发展成了一个 pu。在磁石后应用第3天, 受伤部位显示组织水肿和表皮消失。pu 自发地发展和愈合。然而, 与控制非 sci 小鼠相比, sci 小鼠的愈合速度较控制的非 sci 小鼠慢. 相反, 当伤口在 sci 水平以上产生时, sci 和对照非 sci 小鼠之间的愈合没有差异。这个模型是一个潜在的有用的工具, 以研究 sci 后皮肤 pu 的发展和愈合的动态, 以及测试治疗方法, 可能有助于愈合这种伤口。

引言

压疮 (pu) 是创伤性 sci^{1 的}主要继发并发症。pu 是局部伤害的皮肤和 (或潜在组织), 通常发生在骨性突起, 其中体重集中, 而病人坐在或躺着¹。皮肤、脂肪和肌肉暴露在这种持续的压力下, 导致局部缺血、组织炎症、机械损伤和坏死^{2, 3.}

pu 的发育受几个局部因素的影响, 包括压力和剪切的大小、负荷持续时间、皮肤水分和温度、损伤寿命和一般皮肤卫生。还有一些系统性因素发挥了作用, 如一般身体状况、骨骼和肌肉组织形态和力量⁴、患者年龄、血液学措施、性别, 甚至包括婚姻状况、教育、和收入^4,5。

pu 的预防和治疗仍然是 sci 患者面临的重大挑战。sci 患者在约30-40 的病例中出现 pu, 复发率为 60-85%, 可能是由于疤痕组织薄弱和缺乏保护感 1.因此, pu 往往导致 sci 患者再住院, 总体上对卫生保健系统^{5、6、7、8、9}构成了巨大的经济负担 (仅需增加80% 以上)^,10个。

据我们所知, 由于缺乏合适的动物模型, 目前还没有在可控实验环境中进行研究, 以调查 sci 对 pu 愈合过程的影响。在这里, 一个可重复和临床相关的小鼠模型的 pu 在皮肤上的描述。该模型可用于研究 pu 发病和随后愈合的动态, 以及测试潜在的治疗方法, 以防止 pu 或改善 pu 愈合的情况下, sci。

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研究方案

所有动物处理和外科手术都是根据罗格斯大学动物护理和使用机构委员会批准的协议进行的。给老鼠喂标准饮食和水。

1. 手术和非手术器械的制备

1. 在高压灭菌器中消毒手术和非手术器械。
2. 用70% 乙醇清洁手术台, 并将加热垫加热至37°c。
3. 将加热垫放在手术台上, 并用无菌手术窗帘覆盖。
   请注意:在所有生存过程中, 这里使用 "无接触" 技术来维持无菌。

2. 动物的制备和 t9-t10 脊柱椎板切除术的实施

1. 生成成体 (balbbe) 10周大的雄性老鼠。在每个动物中使用吸入器进行麻醉, 从5% 异氟醚开始, 然后减少到 2-3%, 以维持其余手术的镇静剂。
2. 确认完全麻醉引起任何反应的尾爪夹被诱导的夜感刺激。
3. 用电动剪子把头发剃光在背 (头到尾) 上, 然后涂上脱毛霜 (3分钟), 取出剩余的头发。最后, 用跑步的水/湿擦洗清洗背板, 把动物送回笼子里。
   请注意:这是必要的, 以避免额外的刺激皮肤和化学污染时, 皮肤受伤
4. 第二天, 应用眼药膏角膜, 以保护眼睛在手术过程中不干燥, 然后, 擦洗皮肤与3替代制剂的 betadine 磨砂和70% 乙醇。
5. 用手术刀, 在 t8-t12 椎骨的水平上沿着背部中线进行皮肤切口 (~ 1.0-1.5 厘米)。
   请注意:椎体的水平是通过使用与 t13 椎体^11,12 相对应的漂浮肋骨的位置对 t13 的椎体进行计数来确定的。
6. 清除皮下脂肪组织, 以获得到脊椎旁的肌肉, 然后慢慢解剖他们, 以暴露两侧的刺过程和层。
   请注意:在这一点上, 非常小心地做这个程序, 以避免过度出血或脊髓损伤。
7. 进行椎板切除术, 通过使用显微解剖钳轻轻剥落脊柱层, 露出脊髓 (t9-t10 椎骨)。
   请注意:进行椎板切除术, 使过度的脊髓暴露, 以方便受伤的产生。在对照组中, 只进行椎板切除术。

3. 执行 t9-t10 完全脊髓损伤

1. 使用钳子, 在 t8 固定脊柱, 并抬起, 以夸大脊柱曲率。
2. 使用精细的剪刀, 分割脊髓之间的 t9 和 t10 椎体一路到椎管的地板, 以确保完整的横截面。
3. 在手术显微镜下观察完整的横断后, 在椎板切除术部位涂上一块皮下脂肪, 以便在手术部位关闭之前为脊髓提供额外的保护。
4. 最后, 关闭伤口和缝合椎旁肌肉, 浅表筋膜, 使用连续缝合, 然后关闭皮肤使用缝合夹¹²。
5. 后 sci, 观察第二天的排便情况;然而, 通过手动膀胱排空来管理膀胱。
   请注意:basso 鼠标量表 (bms) 可用于监测 sci 后的后肢功能恢复的进展, 第二天, 然后每周, 见补充图 1^11,12,¹³。

4. 完全 sci 后皮肤压力溃疡的诱导

1. sci 手术后, 立即用 betadine 和70% 的酒精擦洗动物的背部。
2. 对于 sci 站点下的 pu, 在小囊附近的背侧皮肤中注射一个非常小的体积 (10μl), 在等距位置 ~ 0.5-1.0 cm 相距的地方, 在磁铁应用部位周围的椭圆中使用0.125% 布比卡因的非常小的体积 (10μl)。
   请注意:对于 sci 部位上方的 pu, 注射颈椎附近的背侧皮肤。
3. 轻轻抬起鼠标背面的皮肤褶皱, 并将其夹在2个磁盘 (直径 5x12 mm, 每个2.4 克, 3800 g 磁力) 之间 (图 1)。^11,12
4. 在磁铁应用后, 立即将动物送回放置在加热垫上的单个保持架, 直到恢复全意识 (图 1)。
5. 采用12小时后, 用异氟烷轻轻麻醉动物并去除磁铁。拍摄伤口部位的照片, 记录 pu 的首次出现 (第0天时间点)。用透明的衣衣膜 (3m) 覆盖伤口, 以避免干燥或污染。

5. 术后动物护理、安乐死和组织学组织收集

1. 手术后立即给动物注射1毫升0.9% 的生理盐水进行水合作用。
2. 皮下注射丁丙诺非-sr (1 mg/kg) 立即用于镇痛。
3. 每天注射动物美洛昔康 (1 mg kg) 和头孢唑啉 (50 mg kg, 3-7), 每天两次手动膀胱排空。
4. 将动物放在单个笼子里, 并提供可获取的食物和水.完全 sci 的老鼠可以用前肢行走, 毫无困难地接近食物和水。
5. 在 sci 手术后7天内取出手术夹。
6. 在期望的时间点在 sci 和皮肤伤害以后, 通过 co 2 吸入安乐死动物 (3-5分钟), 根据 avma 指南关于安乐死 14.
7. 收集受伤的皮肤样本, 固定在10% 福尔拉林 24小时, 然后在4°c 下储存在70% 乙醇, 直到切片。
8. 为了处理组织, 嵌入石蜡并在微孔上生成薄片 (5μm)。用血红素和 eosin (h & e) 染色, 以显示组织形态 (图 3)。对于免疫组织化学研究 (图 4), 使用适当抗体的 ki67 (增殖)、cd31 (血管生成) 和α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 的染色切片, 如 kumar 等人所述.
   请注意:图像分析软件可用于量化图像特征¹²。

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结果

该协议在完整 sci 的设置中创建了一个 pu. 简单地 (如图 1所示), 所有有完整 sci 或没有完整 sci 的老鼠都能很好地容忍磁体, 在整个12小时内, 磁体保持在原来的位置 (图1c、1c、1c、1c)).所有的小鼠都有两个由正常组织桥隔开的圆形伤口 (图 1e, 1e, 1e)。在没有 sci 的小鼠 (图 1e) 或 sci 站点下方的 sci (...

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讨论

本研究的方案描述了一种新的 pu 实验模型, 以评估 sci 对创面愈合的影响。皮肤 pu 是通过在 sci 部位上方或下方的背侧皮肤褶皱上应用两个直径为12毫米的圆盘磁体12小时诱导的。数据显示, sci 减缓了小鼠皮肤伤口愈合的速度。重要的是, 这些观察是专门在 sci 神经支配水平以下的皮肤伤口中进行的, 因为在 sci 水平以上的伤口, 因此仍然处于神经支配状态, 与非 sci 小鼠相比, 其愈合模式基本没有受到...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636