Модель мыши давление язв после травмы спинного мозга

Резюме

Здесь мы опишем простой способ заставить клинически значимых кожи давление язв (PUs) в модели мыши спинного мозга (SCI). Эта модель может использоваться в доклинических исследованиях экран для различных терапии для исцеления гной в SCI больных.

Аннотация

Давление язвы (PUs) являются общими, изнурительной осложнений травматической спинного мозга (SCI) и, как правило, происходят в мягких тканей вокруг костлявые протуберанцев. Существует однако, мало известно о влиянии SCI на раны кожи исцеление в контексте животных моделей в контролируемых экспериментальных установках. В этом исследовании представлена простая, неинвазивный, воспроизводимые и клинически значимых мыши модель гноя в контексте полного SCI. Взрослых самцов мышей (Balb/c, 10 недель) были бритые и depilated. После депиляции (24 h), мышей были подвергнуты Ламинэктомия следуют полный спинного перерезка (T9-T10 позвонков). Сразу же после этого складку кожи на задней части мышей был отменен и зажатой между двумя магнитные диски, удерживается на месте на следующий 12 h, таким образом создавая ишемические области, которая превратилась в ПУ в последующие дни. Раненых области продемонстрировал отек тканей и эпидермальный исчезновение приложением 3 день после магнит. Гной спонтанно развитых и исцелил. Исцеление, однако, медленнее в SCI мышей по сравнению контролировать-SCI мышей, когда рана была создана ниже уровня наук и наоборот, нет разницы в исцеление был замечен между SCI и управления-SCI мышей, когда рана был создан выше уровня SCI. Эта модель является потенциально полезным инструментом для изучения динамики развития ПУ кожи и заживление после SCI, а также проверить терапевтические подходы, которые могут помочь залечить раны, такие.

Введение

Давление язвы (PUs) являются основными вторичных осложнений травматической SCI¹. Гной, локализованные повреждения кожи и подлежащих тканей, которые обычно происходят на костлявые протуберанцев где вес тела сконцентрировано в то время как пациент сидя или лежа¹. Это постоянное давление, что приводит к развитию локализованных ишемии, воспаление тканей, механических повреждений и некроз^2,3подвергаются кожи, жира и мышц.

Разработка гной зависит от нескольких местных факторов, включая масштабы давления и сдвига, Загрузка продолжительность, влажность кожи и температуры, травмы долголетия и общие кожи гигиены. Существуют также системные факторы, которые играют роль, как общее физическое состояние, кости и мышечной ткани морфологии и прочность⁴, возраст пациента, гематологические меры, пол и даже социально экономических факторов, включая семейное положение, образование, и доходы^4,5.

Профилактики и лечения гной остаются значительные проблемы в SCI больных. SCI пациентов развивается гной в ~ 30-40% случаев, с частотой повторения 60-85%, возможно из-за слабой рубцовой ткани и отсутствие защитных ощущение¹. Таким образом часто приводит к повторной госпитализации больных SCI гной и в целом представляют собой существенное финансовое бремя (80% больше против SCI только) в системе здравоохранения^{5,6,,78,9 , 10}.

В меру наших знаний было без исследований в контролируемых экспериментальных настройки для изучения последствий SCI на процесс заживления пу из-за отсутствия подходящих животных моделей. Здесь описан воспроизводимость и клинически значимых мыши модель Пу в коже. Эта модель может быть использована для изучения динамики пу начала и последующего исцеления, а также для проверки потенциальных терапевтических подходов к предотвращению пу или улучшить ПУ, заживление в контексте SCI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В соответствии с протоколом, утвержденным Ратгерский университет институциональных животное уход и использование Комитета были исполнены все животные обработки и хирургических процедур. Мышей кормили стандартной диете и воды ad libitum.

1. Подготовка хирургических и нехирургических инструментов

1. Стерилизуйте хирургические и нехирургические инструментов в автоклаве.
2. Очистить хирургические операционный стол с 70% этанола и теплая грелка до 37 ° C.
3. Место грелку на операционном столе и накрыть стерильные хирургические шторы.
   Примечание: Во всех процедурах, выживания техника «No Touch» используется здесь для сохранения стерильности.

2. Подготовка животных и выполнение спинного Ламинэктомия Т9 T10

1. Закупать взрослых мышей (Balb/c) 10-недельных мужчины. Побудить анестезии в каждое животное, с использованием ингалятора начиная с 5% изофлюрановая, а затем уменьшить до 2-3% для поддержания седативный эффект на оставшуюся процедур.
2. Подтвердите полной анестезии, вызывая никакого ответа на хвост/лапы крайнем случае индуцированной Ноцицепция стимуляции.
3. Брить волосы на спинку (головы до хвоста), с электрической машинки, а затем применить депиляционный крем (3 мин), чтобы удалить оставшиеся волосы. Наконец мыть спинку с проточной воды/мокрый скраб и вернуть их клетках животных.
   Примечание: Это необходимо, чтобы избежать дополнительного раздражения кожи и химического загрязнения в момент ранения кожи
4. Следующий день, применять глазная мазь для роговицы для защиты глаз от пересыхания во время хирургической процедуры и затем вымыть кожу с 3 альтернативных препаратов Бетадин скраб и 70% этанола.
5. С помощью скальпеля выполните разрез (~1.0-1.5 см) вдоль средней линии на спине на уровне позвонков T8-T12.
   Примечание: Уровень позвонков определяется вернуться подсчета позвонка от T13 используя расположение плавающие ребра, которые соответствуют T13 позвонка^11,12.
6. Очистите подкожной жировой ткани, чтобы получить доступ к paraspinal мышц и затем вскрыть их медленно подвергать остистых отростков и пластинки с обеих сторон.
   Примечание: Сделать эту процедуру очень тщательно, чтобы избежать избыточное кровотечение или любой травмы спинного мозга, на данный момент.
7. Выполните Ламинэктомия подвергать спинного мозга (T9-T10 позвонков), мягко пилинг от позвоночника пластинки, используя пинцет microdissecting.
   Примечание: Выполните ламинэктомии, чтобы избыток спинного подвергается облегчить создание травмы. В группе элементов управления выполняется только Ламинэктомия.

3. выполнение Т9 T10 Полный спинного мозга

1. С помощью щипцов, закрепите позвоночнике Т8 и подъем вверх преувеличивать искривлений позвоночника.
2. С помощью тонкой ножницы, раздел спинного мозга между T9 и T10 позвонка вплоть до пол позвоночного канала, для обеспечения полной перерезка.
3. После наблюдения за полным перерезка под микроскопом хирургические, применение кусок подкожного жира над Ламинэктомия сайт, чтобы предоставить дополнительную защиту спинного мозга до закрытия операции.
4. Наконец закройте рану и шовные паравертебральных мышц, поверхностной фасции, с помощью непрерывного шва и кожи с помощью швов клипы¹².
5. Пост-SCI, наблюдать движение кишечника на следующий день; Однако управлять мочевого пузыря, ручной пузыря эвакуации.
   Примечание: Бассо мыши шкала (BMS) может использоваться для контроля за ходом задних конечностей функциональное восстановление пост SCI на 2 день и затем загрузок, см дополнительная цифра 1^11,12,13.

4. индукция давление язвы кожи после полного SCI

1. Сразу же после операции SCI скраб задней части животного с Бетадин и 70% спирта.
2. Для пу ниже сайта SCI впрыскивают в спинной кожи возле крестец, очень небольшой объем (10 мкл) 0,125% бупивакаин раствора с помощью иглы 25 G в равноотстоящих места ~0.5-1.0 см друг от друга, в эллипса вокруг магнита приложения узла.
   Примечание: Для пу выше сайта SCI придать спинной кожи возле шейки матки региона.
3. Аккуратно поднимите складку кожи на задней части мыши и бутерброд между 2 магнитные диски (5 × 12 мм в диаметре, 2.4 g, 3800 G магнитные силы) (рис. 1). ^{11 , 12}
4. Сразу же после того, как использовать магниты, возвращение животных одной клетки помещаются грелку пока полное сознание не восстановили (рис. 1).
5. После 12 h приложения магнит слегка анестезировать животное с изофлюрановая и удалите магниты. Возьмите фотографию раны сайтов, чтобы записать первоначальный внешний вид Пу (день 0 время точка). Закрыть рану пленкой прозрачной Туалетная (3M) во избежание высыхания или загрязнения.

5. послеоперационный уход за животными, эвтаназия и коллекции тканей для гистологии

1. Сразу после операции придать животное с 1 мл 0,9% физиологического раствора подкожно для гидратации.
2. Подкожно, сразу придать бупренорфин SR (1 мг/кг) для обезболивания.
3. Вводить подкожно животных ежедневно мелоксикам (1 мг/кг) и содержит цефазолина (50 мг/кг за 3-7 дней) и дважды день эвакуации ручной мочевого пузыря.
4. Место животных в одной клетки и обеспечивают доступной пищи и воды ad libitum. Мышей с полным SCI можно ходить с помощью их передние конечности и подход пищи и воды без каких-либо трудностей.
5. Удаление хирургические зажимы 7 дней после операции SCI.
6. В точках желаемое время, после SCI и ранив кожи усыпить животных на CO₂ ингаляции (3-5 мин), в соответствии с руководящими принципами AVMA эвтаназии¹⁴.
7. Сбор образцов раненых кожи, исправить в формалина 10% за 24 часа и затем хранить в 70% этанол на 4 ° C до секционирование.
8. Для обработки тканей, внедрить в парафин и генерировать шлифов (5 мкм) на микротома. Пятно с гематоксилином и эозином (H & E) для визуализации тканей морфологии (рис. 3). Для иммуногистохимии исследований (рис. 4), выведение разделы, используя соответствующие антитела для Ki67 (распространения), CD31 (ангиогенеза) и альфа гладких мышц актина (α-SMA), как описано в Kumar et al.¹²
   Примечание: Программное обеспечение для анализа изображений может использоваться для количественного определения изображения особенности¹².

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол создает ПУ в обстановке полной SCI. кратко (как показано на рис. 1), все модели мыши с или без полного SCI мириться магниты очень хорошо, который оставался в их исходное положение для полного 12 h (рисунки 1 c, 1f, 1 d, 1 h ). Всех мышей разработа?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол в этом исследовании описывает Роман Экспериментальная модель гноя для оценки влияния SCI на заживление ран. Через 12 ч применение двух магнитов-шайб диаметром 12 мм на складку спинной кожи, установить выше или ниже сайта SCI были индуцированной кожи гной. Данные показывают, что SCI з?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636