Modello murino di ulcere da pressione dopo la ferita del midollo spinale

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo semplice per indurre le ulcere di pressione di pelle clinicamente rilevanti (PUs) in un modello murino di ferita del midollo spinale (SCI). Questo modello può essere utilizzato in studi pre-clinici a schermo per diverse terapie per guarigione PUs nei pazienti di SCI.

Abstract

Ulcere da pressione (PUs) sono comuni debilitanti complicazioni della ferita traumatica del midollo spinale (SCI) e tendono a verificarsi nei tessuti molli intorno prominenze ossee. C'è, tuttavia, poco conosciuto circa l'impatto della SCI sulla guarigione di ferite della pelle nel contesto dei modelli animali in impostazioni sperimentali controllate. In questo studio, un modello di mouse semplice, non invasivo, riproducibile e clinicamente rilevanti di PUs nel contesto della completa SCI è presentato. Topi del maschio adulto (Balb/c, vecchio 10 settimane) erano rasati e depilati. Post-depilazione (24h), topi sono stati sottoposti a laminectomia seguita da transection completo del midollo spinale (vertebre T9-T10). Subito dopo, una piega di pelle sul retro dei topi è stata sollevata e intramezzata fra due dischi magnetici, tenuti in posizione per successivo 12 h, creando così una zona ischemica che sviluppata in un PU nei giorni successivi. Le aree ferite ha dimostrato edema del tessuto ed epidermico scomparsa dall'applicazione del post-magnete di giorno 3. PUs spontaneamente sviluppato e guarito. La guarigione era, tuttavia, più lento nei topi SCI rispetto per non-SCI topi di controllo quando la ferita è stata creata sotto il livello della SCI. per contro, si è osservata nessuna differenza nella guarigione tra topi di non-SCI SCI e controllo quando la ferita è stata creata sopra il livello di SCI. Questo modello è uno strumento potenzialmente utile per studiare la dinamica di sviluppo di PU pelle e guarigione dopo SCI, nonché di testare approcci terapeutici che possono aiutare a guarire queste ferite.

Introduzione

Ulcere da pressione (PUs) sono complicazioni importanti secondarie di traumatico SCI¹. PUs sono localizzate le lesioni alla pelle e/o tessuti sottostanti che di solito si verificano sulle prominenze ossee dove il peso corporeo è concentrato mentre il paziente è seduto o sdraiato¹. La pelle, grasso e muscolo sono esposti a questa pressione costante che conduce allo sviluppo di ischemia localizzata, l'infiammazione dei tessuti, danni meccanici e necrosi^2,3.

Lo sviluppo di PUs è influenzato da diversi fattori locali, tra cui l'entità della pressione e taglio, caricamento di durata, l'umidità della pelle e temperatura, longevità di infortuni e igiene generale della pelle. Ci sono anche fattori sistemici che svolgono un ruolo, come condizione fisica generale, osso e morfologia del tessuto del muscolo e forza⁴, età del paziente, misure ematologiche, sesso e fattori anche socio-economici tra cui lo stato civile, istruzione, e reddito^4,5.

La prevenzione ed il trattamento di PUs rimangono sfide significative nei pazienti di SCI. Pazienti di SCI si sviluppano PUs in ~ 30-40% dei casi, con un tasso di re-avvenimento del 60-85%, probabilmente a causa del debole tessuto cicatriziale e la mancanza di sensazione protettiva¹. Così, PUs spesso porta a ri-ospedalizzazione dei pazienti di SCI e nel complesso rappresentano un onere finanziario significativo (80% solo più vs SCI) al sistema di assistenza sanitaria^{5,6,7,8,9 , 10}.

Al meglio della nostra conoscenza, ci sono stati studi in controllato impostazioni sperimentali per studiare l'impatto di SCI sul processo di guarigione PU a causa della mancanza di idonei modelli animali. Qui, un modello riproducibile e clinicamente rilevanti del mouse di PU in pelle è descritto. Questo modello può essere utilizzato per studiare la dinamica dell'inizio di PU e la guarigione successiva, nonché per testare potenziali approcci terapeutici per prevenire PU o migliorare PU guarigione nel contesto di SCI.

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Protocollo

Tutti gli animali gestione e le procedure chirurgiche sono state eseguite in conformità con un protocollo approvato dal comitato di uso e Rutgers University istituzionale Animal Care. Topi sono stati alimentati dieta standard e acqua ad libitum.

1. preparazione di strumenti chirurgici e Non chirurgici

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e non chirurgici in autoclave.
2. Pulire il tavolo operatorio chirurgico con etanolo al 70% e caldo un rilievo di riscaldamento a 37 ° C.
3. Collocare il dissipatore di calore sul tavolo operatorio e coprirlo con teli chirurgici sterili.
   Nota: In tutte le procedure di sopravvivenza, la tecnica "No Touch" è usata qui per mantenere la sterilità.

2. preparazione di animali e di eseguire la laminectomia spinale T9-T10

1. Procurarsi i topi (Balb/c) 10-settimana-vecchio maschio adulti. Indurre l'anestesia in ogni animale con un inizio di inalatore con isoflurano 5% e quindi diminuire a 2-3% per mantenere la sedazione per il resto delle procedure.
2. Confermare la completa anestesia suscitando nessuna risposta ad una stimolazione di nocicezione pizzico indotto coda/zampa.
3. Radersi i capelli sopra il dorsum (testa alla coda) con un clipper elettrico e quindi applicare la crema depilatoria (3 min) per rimuovere i capelli rimanenti. Infine, lavare il dorsum con esecuzione di macchia di acqua/bagnato e restituire gli animali nelle loro gabbie.
   Nota: Ciò è necessario per evitare ulteriori irritazioni alla pelle e contaminazione chimica al momento del ferimento di pelle
4. Il giorno successivo, applicare unguento oftalmico per le cornee per proteggere gli occhi dalla disidratazione durante la procedura chirurgica e poi, strofinare la pelle con 3 preparazioni alternative di betadine scrub e 70% di etanolo.
5. Con un bisturi, è necessario eseguire un'incisione della pelle (~1.0-1.5 cm) lungo la linea mediana sul retro a livello delle vertebre T8-T12.
   Nota: Il livello delle vertebre viene identificato mediante il conteggio indietro la vertebra da T13 utilizzando la posizione delle nervature di galleggiante che corrispondono al T13 vertebra^11,12.
6. Deselezionare il tessuto adiposo sottocutaneo per ottenere accesso ai muscoli di paraspinal e poi li sezionava lentamente per esporre i processi spinous e le lamine su entrambi i lati.
   Nota: Fare questa procedura con molta attenzione per evitare il sanguinamento in eccesso o qualsiasi lesione al midollo spinale, a questo punto.
7. Eseguire un laminectomy per esporre la colonna vertebrale (vertebre T9-T10) di staccando delicatamente la lamina spinale usando il forcipe microdissecting.
   Nota: Eseguire la laminectomia in modo che un eccesso del midollo spinale è esposto per facilitare la creazione della ferita. Nel gruppo di controllo, viene eseguita solo la laminectomia.

3. eseguire la lesione completa del midollo spinale T9-T10

1. Usando il forcipe, sicuro la colonna spinale T8 e ascensore fino ad per esagerare la curvatura spinale.
2. Utilizzando le forbici bene, sezione del midollo tra la vertebra T9 e T10 tutto il senso al pavimento del canale vertebrale, affinché la transection completo.
3. Dopo aver osservato il transection completo sotto un microscopio operatorio, è necessario applicare un pezzo di grasso sottocutaneo sopra il sito di laminectomia per fornire ulteriore protezione al midollo spinale prima della chiusura del sito chirurgico.
4. Infine, chiudere la ferita e suturare i muscoli paravertebrali, fascia superficiale, mediante sutura continua e quindi chiudere la pelle mediante sutura clip¹².
5. Post-SCI, osservare il movimento di viscere il giorno successivo; Tuttavia, il gestore di vescica urinaria di evacuazione manuale della vescica.
   Nota: La scala di Mouse Basso (BMS) può essere utilizzato per monitorare i progressi del hindlimb recupero funzionale post-SCI al giorno 2 e poi settimanale, Vedi complementare figura 1^11,12,13.

4. induzione di ulcera di pressione della pelle dopo SCI completa

1. Immediatamente dopo l'intervento SCI, macchia il dorso dell'animale con betadine e 70% di alcol.
2. Per un PU sotto il sito SCI, iniettare nella pelle dorsale vicino l'osso sacro, un volume molto piccolo (10 µ l) di soluzione di bupivacaina 0,125% utilizzando un ago 25 G al equidistanti posti ~0.5-1.0 cm tra loro, in un ellisse intorno al sito di applicazione del magnete.
   Nota: Per un PU sopra il sito SCI, iniettare la pelle dorsale vicino alla regione cervicale.
3. Sollevare una piega di pelle sul retro del mouse delicatamente e a sandwich tra 2 dischi magnetici (5 × 12 mm di diametro, 2,4 g ciascuna, forza magnetica 3800g) (Figura 1). ^{11 , 12}
4. Subito dopo inserito l'applicazione del magnete, ritorno gli animali nelle gabbie singole un rilievo di riscaldamento fino a quando è piena coscienza riguadagnata (Figura 1).
5. Dopo 12 h di applicazione del magnete, leggermente anestetizzare l'animale con isoflurano e rimuovere i magneti. Fotografare i siti di ferita, per registrare l'aspetto iniziale del PU (giorno 0 tempo di punto). Coprire la ferita con la pellicola di medicazioni trasparenti (3M) essiccazione o contaminazione.

5. post-operatorio cura degli animali, l'eutanasia e raccolta di tessuto per istologia

1. Subito dopo della chirurgia, iniettare l'animale con 1 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% per via sottocutanea per l'idratazione.
2. Iniettare per via sottocutanea buprenorfina-SR (1 mg/kg) immediatamente per analgesia.
3. Iniettare per via sottocutanea animale quotidiano meloxicam (1 mg/kg) e cefazolina (50 mg/kg per 3-7 giorni) e due volte il evacuazione giornaliera di manuale della vescica.
4. Posizionare gli animali in gabbie singole e fornire cibo accessibile e acqua ad libitum. Topi con SCI completa possono camminare con le loro zampe anteriori e avvicinarsi al cibo e acqua senza alcuna difficoltà.
5. Rimuovere la clip chirurgiche 7 giorni dopo l'intervento chirurgico SCI.
6. Presso i punti di tempo desiderato dopo SCI e ferendone pelle, eutanasia animali da inalazione di CO₂ (3-5 min.), in conformità degli orientamenti AVMA eutanasia¹⁴.
7. Raccogliere campioni di pelle ferita, fissare in formalina al 10% per 24 h e quindi memorizzare in etanolo al 70% a 4 ° C fino al sezionamento.
8. Per elaborare tessuti, incorporare in paraffina e generare sezioni sottili (5 µm) su un microtomo. Macchia con ematossilina ed eosina (H & E) per visualizzare la morfologia del tessuto (Figura 3). Per gli studi di immunoistochimica (Figura 4), macchia sezioni utilizzando gli anticorpi adatti per Ki67 (proliferazione), CD31 (angiogenesi) e l'actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) come descritto nel Kumar et al.¹²
   Nota: Software di analisi di immagine consente di quantificare le caratteristiche di immagine¹².

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Risultati

Questo protocollo crea un PU nella cornice del completo SCI. brevemente (come illustrato nella Figura 1), tutti i mouse con o senza SCI completa tollerato i magneti molto bene, che è rimasto nella loro posizione originale per la versione completa 12h (figure 1C, 1D, 1f, 1h ). Tutti i topi hanno sviluppato due ferite circolari separate da un ponte di tessuto normale (Figura 1e, 1G, 1i). La risposta iniziale ferim...

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Discussione

Il protocollo in questo studio descrive un nuovo modello sperimentale di PUs per valutare l'impatto della SCI sulla guarigione della ferita. La pelle di PUs sono state indotte tramite un'applicazione di 12h di due magneti di disco di diametro di 12 mm su una piega di pelle dorsale, impostare sopra o sotto il sito SCI. I dati mostrano che SCI rallenta cicatrizzazione della pelle nei topi. D'importanza, queste osservazioni sono state fatte in particolare nelle ferite della pelle sotto il livello di innervazione del SIC, co...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636