Modelo do rato de úlceras de pressão após lesão medular

Resumo

Aqui, descrevemos um método simples para induzir úlceras de pressão de pele clinicamente relevantes (PUs) em um modelo do rato da lesão medular (SCI). Este modelo pode ser usado em estudos pré-clínicos de tela para diferentes terapias para cura PUs em pacientes SCI.

Resumo

Úlceras de pressão (PUs) são comuns debilitantes complicações da lesão traumática da medula espinhal (SCI) e tendem a ocorrer em tecidos moles em torno de proeminências ósseas. Lá está, no entanto, pouco conhecido sobre o impacto da SCI na pele ferida cura no contexto de modelos animais em configurações experimentais controlados. Neste estudo, é apresentado um modelo simples, não-invasivo, reprodutível e clinicamente relevantes do mouse de PUs no contexto da SCI completa. Ratos machos adultos (Balb/c, 10 semanas de idade) foram raspados e depilados. Pós-depilação (24 h), os ratos foram submetidos a laminectomia seguida por transecção completa da medula espinhal (vértebras de T9-T10). Logo após, uma prega de pele na parte de trás dos ratos foi levantada e imprensada entre dois discos magnéticos no lugar para próxima 12h, criando assim uma área isquêmica que desenvolveu um PU nos dias seguintes. As áreas feridas demonstraram edema do tecido e desaparecimento epidérmico pelo aplicativo de pós-ímã dia 3. PUs espontaneamente desenvolvido e curado. Cura foi, no entanto, mais lento nos ratos SCI comparado para controlar ratos não-SCI quando a ferida foi criada abaixo do nível do Sci. por outro lado, não há diferença na cura foi vista entre SCI e controle não-SCI os ratos quando a ferida foi criada acima do nível do Sci. Este modelo é uma ferramenta potencialmente útil para estudar a dinâmica de desenvolvimento do plutônio de pele e cicatrização depois SCI, bem como para testar abordagens terapêuticas que podem ajudar a curar essas feridas.

Introdução

Úlceras de pressão (PUs) são grandes complicações secundárias de traumático SCI¹. PUs são lesões localizadas da pele e/ou tecidos subjacentes que geralmente ocorrem sobre proeminências ósseas, onde o peso corporal está concentrado, enquanto o paciente está sentado ou deitado¹. A pele, gordura e músculo são expostos a uma pressão constante que leva ao desenvolvimento de isquemia localizada, inflamação do tecido, danos mecânicos e necrose^2,3.

O desenvolvimento de PUs é afetado por vários fatores locais, incluindo a magnitude da pressão e cisalhamento, carregamento duração, umidade da pele e temperatura, longevidade de lesão e higiene geral da pele. Existem também fatores sistêmicos que desempenham um papel, como a condição física geral, osso e morfologia do tecido muscular e força⁴, idade do paciente, medidas hematológicas, sexo e fatores até sócio-econômicos, incluindo o estado civil, educação, e renda^4,5.

A prevenção e o tratamento de PUs permanecem desafios significativos em pacientes SCI. SCI pacientes desenvolvem PUs em ~ 30-40% dos casos, com uma taxa de re-ocorrência de 60-85%, possivelmente devido ao fraco tecido cicatricial e falta de sensação protetora¹. Assim, PUs muitas vezes leva à re-hospitalização de pacientes SCI e em geral representam um encargo financeiro significativo (80% mais vs SCI somente) para o sistema de saúde^{5,6,7,8,9 , 10}.

O melhor de nosso conhecimento, não têm havido estudos nas configurações experimentais controladas para investigar o impacto do SCI sobre o processo de cicatrização do plutônio devido à falta de modelos animais apropriados. Aqui, um modelo de mouse reproduzíveis e clinicamente relevantes do plutônio na pele é descrito. Este modelo pode ser usado para estudar a dinâmica do aparecimento do plutônio e cura posterior, bem como para testar possíveis abordagens terapêuticas para prevenir PU ou melhorar PU cura no contexto da Sci.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todo animal manipulação e procedimentos cirúrgicos foram realizados em conformidade com um protocolo aprovado pelo Comitê de uso e Rutgers University institucional Cuidado Animal. Os ratos foram alimentados com dieta padrão e água ad libitum.

1. preparação dos instrumentos cirúrgicos e não-cirúrgico

1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos e não-cirúrgico em autoclave.
2. Limpar a mesa de operações cirúrgica com 70% de etanol e aqueça uma almofada de aquecimento para 37 ° C.
3. Coloque a almofada de aquecimento na mesa de operações e cubra-o com panos de campo cirúrgicos estéreis.
   Nota: Em todos os procedimentos de sobrevivência, a técnica de "Não tocar" é usada aqui para manter a esterilidade.

2. preparação dos animais e realizando a laminectomia espinhal T9-T10

1. Adquirir ratos adultos (Balb/c) macho de 10 semanas de idade. Induzir a anestesia em cada animal usando um início de inalador com 5% de isoflurano e depois diminuir para 2-3% para manter a sedação para o restante dos procedimentos.
2. Confirme a anestesia completa por não suscitar nenhuma resposta a uma estimulação de nocicepção induzida de pitada cauda/pata.
3. Raspar o cabelo sobre o dorso (a cabeça à cauda) com uma tesoura elétrica e em seguida, aplique o creme depilatório (3 min) para remover os pelos restantes. Finalmente, lave o dorso com água/molhado esfrega em execução e devolver os animais de suas gaiolas.
   Nota: Isso é necessário para evitar irritação adicional para a pele e contaminação química no momento da pele ferindo
4. No dia seguinte, aplique pomada oftálmica córneas para proteger os olhos de secagem durante o procedimento cirúrgico e, em seguida, esfregue a pele com 3 preparações alternativas de betadine esfoliante e 70% de etanol.
5. Com um bisturi, realize uma incisão na pele (~1.0-1.5 cm) ao longo da linha média na parte de trás ao nível da vértebra T12-T8.
   Nota: O nível das vértebras é identificado pela contagem volta da vértebra de T13 usando a localização de costelas flutuantes que correspondem a T13 vértebra^11,12.
6. Limpe o tecido adiposo subcutâneo para obter acesso aos músculos paraspinal e então dissecá-los lentamente para expor os processos espinhosos e lâminas em ambos os lados.
   Nota: Fazer este procedimento com muito cuidado para evitar sangramento excessivo ou lesão da medula espinhal, neste momento.
7. Execute uma laminectomia para expor a medula espinhal (vértebras de T9-T10) por descolar-se suavemente a lâmina vertebral usando fórceps de microdissecting.
   Nota: Execute a laminectomia para que um excesso da medula espinhal é exposto para facilitar a criação da lesão. No grupo controle, somente a laminectomia é executada.

3. realizando a lesão medular completa de T9-T10

1. Usando fórceps, secure coluna vertebral ao T8 e levante até a exagerar a curvatura da coluna vertebral.
2. Com uma tesoura bem, seção entre a vértebra T9 e T10 até o assoalho do canal vertebral, para garantir a completa transecção medular.
3. Depois de observar a transecção completa sob um microscópio cirúrgico, aplique um pedaço de toucinho sobre o site de laminectomia para fornecer proteção adicional para a medula espinhal, antes do encerramento do sítio cirúrgico.
4. Finalmente, fechar a ferida e suturar os músculos paravertebrais, fáscia superficial, utilizando sutura contínua e em seguida, feche a pele usando sutura clipes¹².
5. Post-SCI, observar o movimento do intestino no dia seguinte; no entanto, gerencie a bexiga urinária pela evacuação manual da bexiga.
   Nota: A escala de Mouse Basso (BMS) pode ser usado para monitorar o progresso do membro posterior recuperação funcional pós-SCI no dia 2 e depois semanal, ver Figura complementar 1^11,12,13.

4. indução de úlcera de pressão de pele após SCI completa

1. Imediatamente após a cirurgia SCI, esfrega as costas do animal com betadine e 70% de álcool.
2. Para um PU abaixo do site da SCI, injete na pele dorsal perto do Sacro, um volume muito pequeno (10 µ l) da solução de bupivacaína a 0,125% usando uma agulha 25g em lugares equidistantes ~0.5-1.0 centímetros distante, em uma elipse em torno do local de aplicação do ímã.
   Nota: Para um PU acima o site SCI, injete a pele dorsal perto da região cervical.
3. Delicadamente, levantar uma prega de pele na parte de trás do rato e sanduíche-lo entre 2 discos magnéticos (5 × 12 mm de diâmetro, 2,4 g cada, força magnética de 3800 G) (Figura 1). ^{11 , 12}
4. Imediatamente após a aplicação magnética, animais retorno para gaiolas simples colocado sobre uma almofada de aquecimento até a consciência plena é recuperou (Figura 1).
5. Após 12 h de aplicação magnética, levemente anestesiar o animal com isoflurano e remover os ímãs. Tirar uma fotografia dos sites ferida, para gravar a aparência inicial do plutônio (dia 0 tempo ponto). Cobrir a ferida com film curativo transparente (3M) para evitar a secagem ou contaminação.

5. pós-operatório Cuidado Animal, eutanásia e coleção de tecidos para a histologia

1. Imediatamente após a cirurgia, injete o animal com 1 mL de soro fisiológico a 0,9% por via subcutânea para hidratação.
2. Injecte por via subcutânea buprenorfina-SR (1 mg/kg) imediatamente para analgesia.
3. Injete por via subcutânea animal diariamente meloxicam (1 mg/kg) e cefazolina (50 mg/kg por 3-7 dias) e duas vezes a evacuação da bexiga manual diária.
4. Coloque os animais em gaiolas simples e fornecer alimento acessível e água ad libitum. Ratos com SCI completa podem andar usando suas patas dianteiras e aproximar a comida e a água sem quaisquer dificuldades.
5. Remova os clipes cirúrgicos 7 dias após a cirurgia SCI.
6. Nos pontos de tempo desejado após SCI e pele ferindo, eutanásia em animais por inalação de CO₂ (3-5 min), em conformidade com as diretrizes de AVMA na eutanásia¹⁴.
7. Coletar amostras de pele feridos, corrigir em formol a 10% por 24 h e em seguida, armazenar em etanol a 70% em 4 ° C até seccionamento.
8. Para processar os tecidos, incorporar em parafina e gerar secções finas (5 µm) em um micrótomo. Mancha com hematoxilina e eosina (H & E) para visualizar a morfologia do tecido (Figura 3). Para estudos de imuno-histoquímica (Figura 4), mancha seções usando anticorpos apropriados para Ki67 (proliferação), CD31 (angiogênese) e actina de músculo liso-alfa (α-SMA), conforme descrito no Kumar et al.¹²
   Nota: Software de análise de imagem pode ser usado para quantificar as características de imagem¹².

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este protocolo cria um PU no cenário do Sci. completa brevemente (conforme ilustrado na Figura 1), todos os mouses com ou sem SCI completa tolerado os ímãs muito bem, que permaneceu em sua posição original para o pleno 12 h (figuras 1C, 1D, 1f, 1 h ). Todos os ratos desenvolveram duas feridas circulares, separadas por uma ponte de tecido normal (Figura 1e, 1G, 1i). A resposta inicial ferindo foi semelhante e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O protocolo neste estudo descreve um novo modelo experimental de PUs para avaliar o impacto da SCI na cicatrização de feridas. A pele PUs foram induzidas através de um aplicativo de 12 h de dois ímãs de disco de diâmetro de 12 mm em uma prega de pele dorsal, conjunto acima ou abaixo do site da SCI. Os dados mostram que a SCI retarda cicatrização de feridas de pele em camundongos. Importante, essas observações foram feitas especificamente em feridas de pele abaixo do nível da inervação do SCI, como feridas fe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636