Maus-Modell von Dekubitus nach Verletzungen des Rückenmarks

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um klinisch relevante Haut Dekubitus (PUs) induzieren in einem Mausmodell der Rückenmarksverletzung ("SCI"). Dieses Modell kann in präklinischen Studien als Bildschirm für verschiedene Therapeutika für heilende Eiter im SCI Patienten verwendet werden.

Zusammenfassung

Dekubitus (PUs) sind häufig schwächenden Komplikationen von traumatischer Querschnittlähmung (SCI) und neigen dazu, in weiche Gewebe um knöcherne Protuberanzen auftreten. Es ist allerdings wenig über die Auswirkungen des SCI auf Hautwunden heilen im Kontext von Tiermodellen in kontrollierten experimentellen Einstellungen bekannt. In dieser Studie wird eine einfache, nicht-invasive, reproduzierbare und klinisch relevante Mausmodell der Eiter im Zusammenhang mit der kompletten SCI vorgestellt. Erwachsene männlichen Mäusen (Balb/c, 10 Wochen alt) waren rasiert und Epilation. Post-Epilation (24 h), Mäuse Laminektomie gefolgt von kompletten Rückenmark Durchtrennung (T9-T10-Wirbel) ausgesetzt waren. Unmittelbar nach war eine Hautfalte an der Rückseite der Mäuse aufgehoben und eingeklemmt zwischen zwei magnetischen Scheiben, die an der Stelle für die nächsten 12 h, wodurch es einen ischämischen Bereich, der in den folgenden Tagen zu einem PU entwickelt. Die verwundeten Bereiche zeigte Gewebe Ödem und epidermalen verschwinden von Tag 3 Post-Magnet-Anwendung. Eiter spontan entwickelt und geheilt. Heilung war, jedoch langsamer in den SCI-Mäusen im Vergleich um-SCI Mäuse steuern, wenn die Wunde unter dem Niveau des Sci umgekehrt erstellt wurde, galt keinen Unterschied bei der Heilung zwischen SCI und Kontrolle-SCI-Mäusen Erstellungsdatum die Wunde über dem Niveau des Sci. Dieses Modell ist ein potenziell nützliche Tool, studieren die Dynamik der Haut PU Entwicklung und Heilung nach SCI sowie therapeutische Ansätze zu erproben, die helfen können, solche Wunden zu heilen.

Einleitung

Dekubitus (PUs) sind die wichtigsten sekundären Komplikationen der traumatischen SCI¹. Eiter sind lokalisierte Verletzungen der Haut bzw. darunter liegende Gewebe, die in der Regel über knöchernen Protuberanzen wo ist Körpergewicht konzentriert auftreten, während der Patient sitzen oder liegen¹. Haut, Fett und Muskeln sind diese konstanten Druck ausgesetzt, die zur Entwicklung der lokalisierte Ischämie, Entzündung der Gewebe, mechanische Beschädigungen und Nekrose^2,3führt.

Die Entwicklung von Eiter ist durch mehrere lokale Faktoren, einschließlich des Umfangs der Druck und Scherung, laden, Dauer, Hautfeuchtigkeit und Temperatur, Verletzungen Langlebigkeit und allgemeine Hauthygiene betroffen. Auch gibt es systemische Faktoren, die eine Rolle, wie allgemeine Kondition, Knochen und Muskel Gewebe Morphologie und Stärke⁴, Alter des Patienten, hämatologischen Maßnahmen, Geschlecht und auch sozio-ökonomische Faktoren wie Familienstand, Bildung, und Einkommen^4,5.

Vorbeugung und Behandlung von Eiter bleiben erhebliche Herausforderungen bei SCI Patienten. SCI-Patienten entwickeln sich Eiter in ~ 30-40 % der Fälle mit einem Wiederauftreten von 60-85 %, möglicherweise aufgrund schwacher Narbengewebe und schützende Empfindung¹. So Eiter führt oft zu erneuten Krankenhausaufenthalt SCI Patienten und insgesamt stellen eine beträchtliche finanzielle Belastung (80 % vs. SCI nur) auf das Gesundheitssystem^{5,6,7,8,9 , 10}.

Nach bestem Wissen und gewissen gab es keine Studien in kontrollierten experimentellen Einstellungen, um die Auswirkungen der SCI auf den Heilungsprozess PU wegen des Mangels an geeigneten Tiermodellen untersucht. Hier wird eine reproduzierbare und klinisch relevante Mausmodell der PU in der Haut beschrieben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Dynamik der PU-Beginn und anschließende Heilung zu studieren sowie mögliche therapeutische Ansätze zur Vermeidung PU oder PU im Rahmen des Sci Heilung verbessern zu testen

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Protokoll

Nach einem Protokoll durch die Rutgers University institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt wurden alle Umgang mit Tier und chirurgische Eingriffe durchgeführt. Mäuse wurden Standardkost und Wasser ad libitum gefüttert.

1. Vorbereitung der chirurgische und nicht-chirurgische Instrumente

1. Sterilisieren Sie die chirurgische und nicht-chirurgische Instrumente in einem Autoklaven.
2. Reinigen Sie die chirurgische OP-Tisch mit 70 % Ethanol und ein Heizkissen auf 37 ° c warm
3. Legen Sie das Heizkissen auf dem Operationstisch und bedecken Sie es mit sterilen OP-Tüchern.
   Hinweis: Bei allen überleben Verfahren wird "No Touch" Technik hier verwendet, um Sterilität zu pflegen.

2. Vorbereitung der Tiere und die Durchführung der T9-T10 spinale Laminektomie

1. Erwachsener (Balb/c) 10 Wochen alte männliche Mäuse zu beschaffen. Anästhesie in jedes Tier mit einem Inhalator Anfang mit 5 % Isofluran zu induzieren, und dann 2 bis 3 % Sedierung für den Rest der Verfahren zu verringern.
2. Bestätigen Sie komplette Anästhesie durch keine Reaktion auf eine Heck/Pfote Prise induzierte Nozizeption Stimulation zu entlocken.
3. Rasieren Sie die Haare über der Dorsum (Leiter zum Heck) mit einer elektrischen Haarschneidemaschine, und wenden Sie dann die Enthaarungscreme (3 min) um die verbleibenden Haare zu entfernen. Schließlich waschen Sie den Handrücken mit fließendem Wasser/nass Scheuern und Rückkehr der Tiere in ihren Käfigen.
   Hinweis: Dies ist notwendig, um weitere Reizungen der Haut und chemische Kontamination zum Zeitpunkt der Verwundung der Haut zu vermeiden
4. Wenden Sie am nächsten Tag an, ophthalmologische Salbe auf die Hornhaut zu schützen die Augen vor dem Austrocknen während des chirurgischen Eingriffs und dann reiben Sie die Haut mit 3 alternative Präparate von Betadine Scrub mit 70 % ethanol
5. Führen Sie mit einem Skalpell einen Hautschnitt (~1.0-1.5 cm) entlang der Mittellinie auf dem Rücken auf der Ebene der T8-T12 Wirbel.
   Hinweis: Die Höhe der Wirbel wird durch zurück zählen die Wirbel von T13 mit den Speicherort der schwimmende Rippen, die T13 Wirbel^11,12entsprechen, identifiziert.
6. Deaktivieren Sie das subkutane Fettgewebe um Zugang zu den paraspinalen Muskeln und dann zerlegen sie langsam um die Dornfortsätze und Schichten auf beiden Seiten sichtbar.
   Hinweis: Tun Sie dieses Verfahren sehr sorgfältig, um übermäßige Blutungen oder Verletzungen des Rückenmarks, an dieser Stelle zu vermeiden.
7. Führen Sie eine Laminektomie um das Rückenmark (T9-T10-Wirbel) verfügbar machen, indem der spinalen Lamina mit Microdissecting Pinzette vorsichtig abziehen.
   Hinweis: Führen Sie die Laminektomie, so dass ein Übermaß an das Rückenmark ausgesetzt ist, um die Erstellung der Verletzung zu erleichtern. In der Kontrollgruppe wird nur die Laminektomie durchgeführt.

3. Durchführung der T9-T10 komplette Querschnittlähmung

1. Mit Pinzette, sichern Sie die Wirbelsäule beim T8 und Auftrieb die Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben.
2. Mit einer feinen Schere, Abschnitt des Rückenmarks zwischen T9 und T10 Wirbel bis zum Boden des vertebralen Kanals, um vollständige Durchtrennung zu gewährleisten.
3. Wenden Sie nachdem er beobachtet die vollständige Durchtrennung unter einem Operationsmikroskop ein Stück des subkutanen Fettgewebes über die Laminektomie-Website, um zusätzlichen Schutz des Rückenmarks vor Schließung der Operationsstelle bieten.
4. Schließlich schließen Sie die Wunde und Naht der paravertebralen Muskeln, oberflächliche Faszie, mit kontinuierlicher Naht und schließen Sie dann die Haut mit Naht Clips¹².
5. Post-SCI, beobachten den Stuhlgang am nächsten Tag; Dennoch gelingt es der Harnblase durch manuelle Blase Evakuierung.
   Hinweis: Der Basso Maus Skala (BMS) kann verwendet werden zur Überwachung des Fortschritts der Megalosauridae funktionelle Wiederherstellung Post-SCI am 2. Tag und dann wöchentlich, siehe ergänzende Abbildung1^11,12,13.

(4) Induktion von Haut Dekubitus nach komplette SCI

1. Unmittelbar nach der Operation SCI Schrubben Sie den Rücken des Tieres mit Betadine und 70 % Alkohol.
2. Spritzen Sie für eine PU unter der SCI Website in die Rückenhaut nahe dem Kreuzbein, einem sehr kleinen Volumen (10 µL) 0,125 % Bupivacain Lösung mit einer 25 G Nadel äquidistant Orte ~0.5-1.0 cm voneinander entfernt, in einer Ellipse um die Applikationsstelle Magnet.
   Hinweis: Injizieren Sie für ein PU oberhalb der SCI Stelle die dorsale Haut in der Nähe der zervikalen Region.
3. Heben Sie eine Hautfalte an der Rückseite der Maus und zwischen 2 magnetische Scheiben (5 × 12 mm Durchmesser und 2,4 g, 3800 G Magnetkraft) sandwich (Abbildung 1). ^{11 , 12}
4. Unmittelbar nach der Anwendung, Rückkehr Tiere in einzelne Käfige aufgesetzt gewann ein Heizkissen bis vollständige Bewusstsein ist (Abbildung 1).
5. Nach 12 h von Magnet-Anwendung leicht Tier mit Isofluran zu betäuben und die Magneten zu entfernen. Fotografieren Sie die Wunde Websites, um das ursprüngliche Aussehen des PU aufzunehmen (Tag 0 Zeit Punkt). Decken Sie die Wunde mit transparente Verband Film (3M), Trocknung oder Kontamination zu vermeiden.

5. postoperative Pflege der Tiere, Euthanasie und Gewebe-Kollektion für Histologie

1. Unmittelbar nach der Operation Spritzen Sie das Tier mit 1 mL 0,9 % Kochsalzlösung subkutan für Trinksystem.
2. Subkutan injizieren Sie Buprenorphin-SR (1 mg/kg) sofort für Analgesie.
3. Spritzen Sie subkutan Tier täglich Meloxicam (1 mg/kg), und Cefazolin (50 mg/kg für 3-7 Tage) und zweimal tägliche manuelle Blase Evakuierung.
4. Setzen Sie Tiere in einzelne Käfige und zugängliche Nahrung und Wasser Ad Libitum. Mäuse mit kompletten SCI einen Spaziergang mit ihrer Vorderbeine und nähern sich die Nahrung und Wasser ohne Schwierigkeiten.
5. Entfernen Sie 7 Tage postoperativ SCI chirurgische Clips.
6. Zu den gewünschten Zeitpunkten nach SCI und verletzte Haut einschläfern Sie Tiere durch CO₂ Inhalation (3-5 min), gemäß den Leitlinien der AVMA zur Euthanasie¹⁴.
7. Verwundeten Hautproben zu sammeln, in 10 % Formalin für 24 h zu beheben und dann bis zur Aufteilung in 70 % igem Ethanol bei 4 ° C lagern.
8. Um Gewebe zu verarbeiten, in Paraffin eingebettet und Dünnschliffen (5 µm) auf ein Mikrotom zu generieren. Färben Sie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Gewebe Morphologie (Abbildung 3) zu visualisieren. Für immunhistochemische Studien (Abbildung 4), färben Abschnitte mit entsprechenden Antikörpern für Ki67 (Proliferation), CD31 (Angiogenese) und Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA) beschriebenen Kumar Et Al.¹²
   Hinweis: Bildanalyse-Software kann verwendet werden, Bild Funktionen¹²zu quantifizieren.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll schafft eine PU in der Umgebung des kompletten Sci kurz (wie in Abbildung 1dargestellt), alle Mäuse mit oder ohne komplette SCI die Magnete sehr gut vertragen, die blieben in ihrer ursprünglichen Position für die volle 12 h (Abb. 1 c, 1D, 1f, 1 h ). Die Mäuse entwickelten zwei kreisrunde Wunden, die durch eine Brücke des normalen Gewebes (Abb. 1e, 1 g, 1i) getrennt. Der erste verletzte Antwo...

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Diskussion

Das Protokoll in dieser Studie beschreibt ein neuartige experimentelles Modell der Eiter Bewertung die Auswirkungen von SCI auf die Wundheilung. Die Haut Eiter waren veranlasst, über eine 12 h-Applikation von zwei 12 mm Durchmesser Scheibenmagnete auf eine dorsale Hautfalte, entweder oberhalb oder unterhalb der SCI-Website einstellen. Daten zeigen, dass SCI verlangsamt sich die Wundheilung der Haut bei Mäusen. Wichtig ist, diese Beobachtungen wurden speziell in Hautwunden unterhalb Innervation des SCI, als Wunden ü SC...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636