Modelo de ratón de úlceras por presión después de lesión de médula espinal

Resumen

Aquí, describimos un método simple para inducir úlceras piel clínicamente relevantes (PUs) en un modelo murino de lesión de la médula espinal (SCI). Este modelo puede utilizarse en los estudios preclínicos a la pantalla para diferentes terapias de sanación PUs en pacientes.

Resumen

Las úlceras por presión (PUs) son comunes debilitantes complicaciones de lesión traumática de la médula espinal (SCI) y tienden a ocurrir en los tejidos blandos alrededor de las prominencias óseas. Se, sin embargo, conoce poco sobre el impacto del SCI en curación de herida en la piel en el contexto de modelos animales en entornos experimentales controlados. En este estudio, se presenta un modelo de ratón simple, no invasivo, reproducible y clínicamente relevante de PUs en el contexto de lesión medular completa. Ratones machos adultos (Balb/c, 10 semanas de edad) eran afeitados y depilados. Post-depilatorio (24 h), ratones fueron sometidos a laminectomía seguida de transección completa de la médula espinal (vértebras T9-T10). Inmediatamente después, un pliegue de piel en la parte posterior de los ratones fue levantado e intercalado entre dos discos magnéticos en lugar de siguiente 12 h, creando así un área isquémico que en los próximos días se convirtió en un PU. Las áreas heridas demostraron edema de tejido y desaparición epidérmico por solicitud posterior al día 3. PUs espontáneamente desarrollado y curado. Curación fue, sin embargo, más lento en los ratones SCI comparado para controlar ratones no SCI cuando la herida fue creada por debajo del nivel por el contrario, no en la curación se observaron diferencias entre ratones de no SCI SCI y control cuando la herida fue creada por encima del nivel de la médula espinal. Este modelo es una herramienta potencialmente útil para el estudio de la dinámica de desarrollo de PU de la piel y cicatrización después de SCI, así como a prueba enfoques terapéuticos que pueden ayudar a curar esas heridas.

Introducción

Las úlceras por presión (PUs) son complicaciones secundarias principales de SCI traumático¹. PUs son lesiones localizadas en la piel o tejidos subyacentes que ocurren generalmente sobre las prominencias óseas donde se concentra el peso del cuerpo mientras el paciente está sentado o acostado¹. La piel, grasa y músculo están expuestos a esta presión constante que lleva al desarrollo de isquemia localizada, inflamación de los tejidos, daño mecánico y necrosis^2,3.

El desarrollo de PUs es afectado por varios factores, incluyendo la magnitud de presión y de esquileo, carga duración, humedad de la piel y temperatura, longevidad de la lesión y la higiene general de la piel. También existen factores sistémicos que influyen, como la condición física general, hueso y morfología de tejido muscular y de fuerza⁴, edad del paciente, medidas hematológicas, género y factores socio-económicos incluso como estado civil, educación, y renta^4,5.

La prevención y tratamiento de PUs siguen siendo retos significativos en pacientes. Pacientes desarrollan PUs en ~ 30-40% de los casos, con una tasa de re-ocurrencia de 60-85%, posiblemente debido a la débil formación de tejido cicatricial y la falta de sensación protectora¹. Así, PUs a menudo conduce a la hospitalización de pacientes y en general representan una carga financiera significativa (80% vs SCI sólo) al sistema de salud^{5,6,7,8,9 , 10}.

A lo mejor de nuestro conocimiento, no ha habido ningún estudio en ajustes experimentales controladas para investigar el impacto del SCI en el proceso de curación de PU debido a la falta de modelos animales adecuados. Aquí, se describe un modelo de ratón reproducible y clínicamente relevante de la PU de la piel. Este modelo puede utilizarse para estudiar la dinámica de aparición de la PU y curación posterior, así como para poner a prueba enfoques terapéuticos potenciales para prevenir PU o mejorar PU en el contexto de la médula espinal.

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Protocolo

Todo manejo de animales y procedimientos quirúrgicos fueron realizados conforme a un protocolo aprobado por la Universidad de Rutgers institucional Animal cuidado y uso. Ratones fueron alimentados con dieta estándar y agua ad libitum.

1. preparación de instrumentos quirúrgicos y no quirúrgicos

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y no quirúrgicos en el autoclave.
2. Limpiar la mesa de operaciones quirúrgica con etanol al 70% y caliente una almohadilla térmica a 37 ° C.
3. Coloque la almohada en la mesa de operaciones y cubrir con cortinas quirúrgicas estériles.
   Nota: En todos los procedimientos de supervivencia, la técnica "No Touch" se utiliza aquí para mantener la esterilidad.

2. preparación de animales y realizar la laminectomía espinal T9-T10

1. Provéase de ratones (Balb/c)-semana-varón de 10 adultos. Inducir la anestesia en cada animal con un principio de inhalador 5% isoflurano y luego reducir a 2-3% para mantener la sedación para el resto de los procedimientos.
2. Por que no hay respuesta a un estímulo de cola/var pizca inducida por nocicepción confirman la anestesia completa.
3. Afeitar el pelo del dorso (cabeza a cola) con una maquinilla eléctrica y luego aplicar la crema depilatoria (3 minutos) para eliminar el pelo restante. Finalmente, lave el dorso con corriente de agua y húmedos matorrales y regresar los animales a sus jaulas.
   Nota: Esto es necesario para evitar más irritación a la piel y la contaminación química en el momento de herir la piel
4. Al día siguiente, aplicar pomada oftálmica a las córneas para proteger los ojos de secado durante el procedimiento quirúrgico y a continuación, frote la piel con 3 preparaciones alternativas de betadine scrub y el 70% de etanol.
5. Con un bisturí, realizar una incisión en la piel (~1.0-1.5 cm) a lo largo de la línea media en la parte posterior a nivel de las vértebras T8-T12.
   Nota: El nivel de las vértebras se identifica nuevamente contando la vértebra de T13 con la ubicación de las costillas flotantes que corresponden a T13 vértebra^11,12.
6. Eliminar el tejido adiposo subcutáneo para obtener acceso a los músculos del paraspinal y luego disecar lentamente para exponer la apófisis espinosas y láminas en ambos lados.
   Nota: Hacer este procedimiento con mucho cuidado para evitar sangrado excesivo o cualquier lesión a la médula espinal, en este punto.
7. Realizar una laminectomía para exponer la médula espinal (vértebras T9-T10) desprendiendo suavemente la lámina espinal utilizando pinzas de microdissecting.
   Nota: Realizar la laminectomía para que un exceso de la médula espinal está expuesto para facilitar la creación de la lesión. En el grupo control, solamente la laminectomía se realiza.

3. realización de la lesión de médula espinal completa T9-T10

1. Con pinzas, fije la columna vertebral en T8 y elevación hasta exagerar la curvatura de la columna.
2. Con unas tijeras finas, sección de la médula espinal entre la vértebra T9 y T10 hasta el piso del canal vertebral, para asegurar la transección completa.
3. Después de observar el transection completo bajo microscopio quirúrgico, aplique un trozo de grasa subcutánea en el sitio de laminectomía para proporcionar protección adicional a la médula espinal antes del cierre del sitio quirúrgico.
4. Finalmente, cerrar la herida y la sutura de la musculatura paravertebral, fascia superficial, con sutura continua y luego cierre la piel con sutura clips¹².
5. Post-SCI, observar el movimiento del intestino en el día siguiente; sin embargo, gestionar la vejiga urinaria por evacuación de vejiga manual.
   Nota: La escala de ratón de Basso (BMS) puede ser utilizado para monitorear el progreso del miembro posterior recuperación funcional post-SCI en día 2 y luego semanal, ver complementarios Figura 1^11,12,13.

4. inducción de úlcera de la presión de la piel después de SCI completa

1. Inmediatamente después de la cirugía SCI, frote la parte posterior del animal con betadine y 70% de alcohol.
2. Por un PU debajo del sitio SCI, inyectar en la piel dorsal cerca del sacro, un volumen muy pequeño (10 μl) de solución de bupivacaína 0.125% usando una aguja de 25 G en lugares equidistantes ~0.5-1.0 cm aparte, en una elipse alrededor del sitio de aplicación del imán.
   Nota: Por un PU sobre el sitio SCI, inyectar la piel dorsal cerca de la región cervical.
3. Levantar un pliegue de piel en la parte posterior del ratón cuidadosamente y emparedado entre 2 discos magnéticos (5 × 12 mm de diámetro y 2,4 g, fuerza magnética de 3800 G) (figura 1). ^{11 , 12}
4. Inmediatamente después de solicitud, animales regreso a las jaulas individuales se coloca sobre una almohada hasta que el sentido completo es había recuperado (figura 1).
5. Después de 12 h de la solicitud, ligeramente anestesiar animales con isoflurano y quitar los imanes. Tomar una fotografía de los sitios de la herida, para registrar la aparición de la PU (día hora 0 punto). Cubrir la herida con la película de apósito transparente (3M) para evitar sequedad o contaminación.

5. postoperatorio cuidado de los animales, la eutanasia y la colección de tejidos para histología

1. Inmediatamente después de la cirugía, inyectar los animales con 1 mL de solución salina 0.9% por vía subcutánea para la hidratación.
2. Inyectar por vía subcutánea buprenorfina-SR (1 mg/kg) inmediatamente para la analgesia.
3. Inyecte meloxicam por vía subcutánea animal diaria (1 mg/kg) y cefazolina (50 mg/kg durante 3-7 días) y dos veces diaria evacuación vesical manual.
4. Animales en jaulas individuales y proporcionar comida accesible y agua ad libitum. Ratones con SCI completa pueden caminar con sus patas delanteras y acercarse a la comida y el agua sin dificultad.
5. Saque los clips quirúrgicos 7 días después de la cirugía SCI.
6. En los puntos de tiempo deseado después de SCI y herir la piel, eutanasia animales por inhalación de CO₂ (3-5 min), con arreglo a las pautas de AVMA en eutanasia¹⁴.
7. Recoger muestras de piel heridas, fijar en formol al 10% durante 24 h y luego almacenar en etanol al 70% a 4 ° C hasta seccionar.
8. Para procesar los tejidos, incluir en parafina y generar secciones delgadas (5 μm) en un micrótomo. Tinción con hematoxilina y eosina (H & E) para visualizar la morfología del tejido (figura 3). Estudios de inmunohistoquímica (figura 4), la mancha secciones usando los anticuerpos apropiados para Ki67 (proliferación), CD31 (angiogénesis) y la actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) como se describe en¹² de Kumar et al.
   Nota: Software de análisis de imagen puede utilizarse para cuantificar características imagen¹².

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Resultados

Este protocolo crea un PU en el ajuste de brevemente al completo (como se ilustra en la figura 1), todos los ratones con o sin SCI completa toleraron muy bien, los imanes que permanecía en su posición original para máximo 12 h (figuras 1C, 1D, 1f, 1 h ). Todos los ratones desarrollaron dos heridas circulares separadas por un puente de tejido normal (Figura 1e, 1 g, 1i). La respuesta inicial de la herida fue si...

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Discusión

El protocolo en este estudio describe un nuevo modelo experimental de PUs para evaluar el impacto del SCI en la cicatrización de heridas. La piel PUs fueron inducidos a través de una aplicación de 12 h de dos imanes de disco de diámetro de 12 mm en un pliegue de piel dorsal, bien situado por encima o por debajo del sitio SCI. Los datos muestran que SCI retrasa la cicatrización de la piel en ratones. Importante, estas observaciones fueron hechas específicamente en heridas de la piel por debajo del nivel de inervaci?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636