褥瘡脊髄損傷後のマウス ・ モデル

要約

ここでは、脊髄損傷 (SCI) のマウスモデルで臨床的に関連する皮膚褥瘡 (膿) を誘導する単純な方法を説明します。このモデルは、SCI の患者の治癒の膿の異なる治療の画面に前臨床試験で使用できます。

要約

褥瘡 (膿) は一般的な外傷性脊髄損傷 (SCI) の合併症を衰弱させる、骨の出っぱりの周りの軟部組織に発生する傾向があります。しかし、ほとんど知られている SCI の動物モデルの制御の実験設定のコンテキストで創傷治癒への影響について。本研究では完全な科学のコンテキストで膿の単純な非侵襲的、再現性と臨床的に関連するマウス モデルに示します。成人男性マウス (Balb/c, 10 週齢) は、剃毛され、depilated。後脱毛 (24 h)、マウスは完全脊髄損傷 (T9 T10 椎) 続いて椎弓切除術を受けた。直後、マウスの背中の皮膚のひだは解除され次の日間、PU に開発した虚血領域を作成、次の 12 時間行われて 2 つの磁気ディスクの間に挟まれた。負傷者の領域は、3 日目後磁石アプリケーションによって組織の浮腫と表皮の消失を実証しました。膿は自発的に開発し、癒されます。癒し、ただし、SCI マウスより遅い比較傷が逆に科学のレベルの下に作成されたときは、非-SCI マウスを制御するため癒しの違い間みられなかった SCI とコントロールの非-SCI マウス理レベル上傷が作成されたときこのモデルは、皮膚 PU 開発と SCI もこのような傷を癒す治療法をテスト後の治癒過程のダイナミクスを検討する可能性がある便利なツールです。

概要

圧力潰瘍 (膿) は、外傷性の科学¹の主要な合併症です。膿は、皮膚および/または患者が座っているまたは¹を横になっているときに、体重が集結している骨の出っぱりに通常発生する基になる組織にローカライズされた傷害です。皮膚、脂肪、および筋肉は、ローカライズされた虚血、組織の炎症、機械的損傷、壊死^2,3の開発につながるこの一定の圧力にさらされています。

膿の開発は、圧力・せん断、期間、皮膚の水分と温度、傷害長寿、一般的な皮膚の衛生状態の大きさを含むいくつかのローカル要因の影響を受けます。一般的な物理的な条件、骨と筋組織形態と強度⁴、患者の年齢、血液対策、性別、婚姻状況、教育なども社会経済的要因などの役割を果たす全身的要因もあります。所得^4,5。

予防と膿の治療科学における重要な課題のままです。SCI 患者は、おそらく弱い瘢痕組織と保護の感覚¹の不足のための 60-85% の再出現率を症例の 30 〜 40% で膿を開発します。したがって、膿は SCI の患者の再入院につながるし、全体的なヘルスケア ・ システム^5,6,7,8,9 (80% 以上 SCI 対のみ) 重要な財務負担をもたらす^,10。

我々 の知る限りになかった研究の適切な動物モデルの欠乏のための PU の治癒過程における科学の影響を調査する実験制御の設定。ここでは、皮膚の PU の再現性と臨床的に関連するマウスのモデルを説明します。PU 発症とその後の癒しのダイナミクスを研究するほか、PU を防止または癒しの科学のコンテキストで PU を改善する潜在的な治療アプローチをテストする、このモデルを使用することができます。

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プロトコル

ラトガース大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従ったすべての動物取扱および外科プロシージャを行った。マウスは、標準的な食事とアドリブの水を供給しました。

1. 手術と非手術器械の準備

1. オートクレーブの手術と非手術器械を滅菌します。
2. 70% エタノールで外科手術台をきれいにし、37 ° C に加熱パッドをウォーム アップ
3. オペレーティング テーブルの上に加熱パッドを配置し、滅菌外科用ドレープでそれをカバーします。
   注:すべての生存の手順で「ノータッチ」手法は、無菌性を維持するためにここで使用します。

2. 動物の T9 T10 脊椎椎弓切除を行う準備

1. アダルト (Balb/c) 10 週齢雄マウスを調達します。5% イソフルレン吸入器の先頭を使用してそれぞれの動物の麻酔し、手順の残りの部分のための鎮静を維持するために 2-3% に低下します。
2. 尻尾か足ピンチによる侵害受容刺激への応答を引き出すことないが完全な麻酔を確認します。
3. 残りの髪を削除する脱毛クリーム (3 分) を適用し、電気クリッパーと背 (頭/尾) に髪を剃る。最後に、水/濡れているスクラブを実行すると背を洗うし、自分のケージに動物を返します。
   注:これは皮膚と皮膚が負傷した時の化学物質汚染に追加の刺激を避けるために必要です。
4. 次の日は、手術中に乾燥から目を保護し、betadine スクラブと 70% のエタノールの 3 の代替製剤で皮膚をこすって角膜に眼軟膏を適用します。
5. メス、T8 T12 椎体のレベルで背面の正中線に沿って皮膚切開 (~1.0-1.5 cm) を実行します。
   注:椎体のレベルは、戻って T13 椎^11,12に対応する浮動肋骨の位置 T13 から椎体をカウントすることによって識別されます。
6. 傍脊柱筋群へのアクセスを取得し、ゆっくりと棘突起と双方のラミナを公開するそれらを解剖する皮下脂肪をオフにします。
   注:過剰な出血、または脊髄への損傷は、この時点を避けるために非常に慎重にこの手順を行います。
7. Microdissecting 鉗子を使用して脊髄をそっと剥がして脊髄 (T9 T10 椎) を公開する椎弓切除術を行います。
   注:傷害の作成が容易に脊髄の過剰を露出するように、椎弓切除術を実行します。コントロール群では、椎弓切除術のみが実行されます。

3. T9 T10 完全脊髄損傷を実行します。

1. 鉗子を使用して、脊柱の彎曲を誇張するを持ち上げ、T8 で脊柱を固定します。
2. 良いはさみを使用して、完全断裂を確保するため、脊柱管の床に T9 と T10 の椎骨の間の脊髄のセクションします。
3. 手術顕微鏡下で完全断裂を観察し、脊髄外科サイト閉鎖前に追加の保護を提供するために椎弓切除術のサイトに皮下脂肪の一部を適用します。
4. 最後に、傷を閉じると傍脊柱筋、連続縫合糸を使用して、浅筋膜を縫合し、皮膚縫合クリップ¹²を使用してを閉じます。
5. ポスト-SCI、次の日に腸の動きを観察ただし、避難マニュアル膀胱による膀胱を管理します。
   注:通奏低音マウス スケール (BMS) はことを 2 日目で後肢の機能回復のポスト-SCI の進行状況を監視するために使用、その後、毎週、補足図 1^11,12,13を参照してください。

4. 完全な SCI 後皮膚褥瘡の誘導

1. SCI 手術直後後 betadine と 70% アルコールで動物の背中をスクラブします。
2. SCI のサイトの下の PU、仙骨、0.125% ブピバカイン ソリューション等距離の場所 ~0.5-1.0 cm 以外は、磁石アプリケーション サイトを楕円に 25 G 針を使用しての非常に小さい量 (10 μ L) 近くの背側皮膚に注入します。
   注:SCI サイト上記 PU の頸部近く背の皮膚を注入します。
3. 軽くマウスの背中の皮膚のひだを持ち上げて 2 磁気ディスク (5 × 12 mm の直径、2.4 g、3800 G の磁気力) で挟む (図 1)。^11,12
4. 磁石アプリケーション、1 つのケージに戻り動物が置いた後すぐに加熱パッドは、完全な意識までは (図 1) を取り戻した。
5. 磁気応用の 12 h 後軽くイソフルランと動物を麻酔し、磁石を削除します。PU の初期の外観を記録する、傷のサイトの写真を撮る (日 0 時間ポイント)。乾燥や汚染を避けるために透明ドレッシング フィルム (3 M) で傷をカバーしてください。

5. 術後の動物の世話、安楽死、と組織学のティッシュのコレクション

1. 手術後すぐに動物皮下水分補給のための 0.9% 生理食塩水 1 mL を注入します。
2. 鎮痛のため、すぐにブプレノルフィン SR (1 mg/kg) を皮下注入します。
3. 2 回毎日手動膀胱避難とセファゾリン (50 mg/kg の 3-7 日間)、皮下動物毎日メロキシカム (1 mg/kg) を挿入します。
4. 1 つのケージに動物を配置し、アクセス可能な食糧を提供する水の自由。完全な sci マウスは、前肢を使用して歩くし、食料と水難しさなしにアプローチできます。
5. SCI 術後後 7 日外科用クリップを削除します。
6. SCI と皮膚が負傷した後必要な時点で安楽死¹⁴AVMA 要領に基づいて CO₂吸入 (3-5 分) で動物を安楽死します。
7. 傷ついた皮膚を採取、24 h の 10% ホルマリンで固定し、断面まで 4 ° C で 70% エタノールに保管します。
8. 組織を処理、パラフィンに埋め込むし、ミクロトームで薄切片 (5 μ m) を生成します。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 組織形態 (図 3) を視覚化するために染まります。免疫組織化学的研究 (図 4)、セクション キ67 適切な抗体を用いた染色 (増殖)、CD31 (血管新生) と α-平滑筋アクチン Kumar ら¹²に記載 (α SMA)
   注:画像解析ソフトウェアは、イメージの機能¹²を定量化する使用できます。

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結果

このプロトコルは、の完全な科学は簡単に設定で PU を作成します (図 1に示されている) として、すべてマウスに完全な SCI 容認磁石非常によく (図 1 c、1 d、1 階、1 hの 12 h の元の位置に残って).すべてのマウスは、正常の組織 (図 1e, 1 g, 1i) の橋で区切られた 2 つの円形傷を開発しました。負傷の初期応答はマウ...

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ディスカッション

本研究ではプロトコルでは、膿は SCI の創傷治癒への影響を評価するための新しい実験モデルについて説明します。皮膚の膿は、背側皮膚のひだは、上または SCI のサイトの設定の 2 つの 12 mm 径ディスク磁石の 12 h アプリケーション経由で誘導された.データは、SCI をマウスの皮膚創傷治癒を遅らせることを示します。重要なは、専用に SCI レベル上で作った傷として、SCI の神経レベルの下の...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnets	Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Magnetic force
Mice standard diet	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Image Analysis Software
BETADINE Surgical Scrub	HENRY SCHEIN Animal Health
Ophthalmic Ointment	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 008897
NAIR-Hair Remover Lotion	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (meloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 049755	5 mg/mL, 10 mL
Cefazolin Sodium	HENRY SCHEIN Animal Health	SKU 054846	1 g, 10 mL bottle
Buprenorphine-SR	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0.9% Sodium Chloride Injection USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10% Neutral Buffered Formalin	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Male Mouse	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Sterile Cotton Tipped Applicator	Puritan, Guilford, ME	SKU#: 25-806
Michel Suture Clips	Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Surgical Suture, U.S.P.	Henry Schein Animal Health	101-2636