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  • 参考文献
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摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 自动确定果蝇的运动性能在变化的温度使用可编程温度控制竞技场, 产生快速和准确的温度变化的时间和空间。

摘要

温度是影响物种分布和行为的普遍环境因素。不同种类果蝇对温度变化的生理耐受性和适应性有特定的反应。果蝇还拥有一个温度传感系统, 已成为了解变温动物温度处理的神经基础的基础。我们在这里提供一个温度控制的竞技场, 允许快速和精确的温度变化与时间和空间控制, 以探索个别苍蝇对变化的温度的反应。单独的苍蝇被放置在竞技场和暴露在预编程的温度挑战, 如均匀逐渐增加的温度, 以确定反应规范或空间分布的温度在同一时间确定偏好。自动跟踪个人, 允许量化速度或位置偏好。此方法可用于快速量化在大范围温度下的响应, 以确定果蝇或其他类似大小的昆虫的温度性能曲线。此外, 它还可用于基因研究, 以量化突变体或野生型苍蝇的温度偏好和反应。该方法可以帮助揭示热形态和适应的基础, 以及温度处理后的神经机制。

引言

温度是一个持续的环境因素, 影响生物体的功能和行为1。纬度和海拔高度的差异导致气候有机体类型的差异, 这导致了他们对温度2,3反应的进化选择。生物体通过形态学、生理和行为适应来响应不同的温度, 从而在其特定环境下实现最佳性能4。例如, 在果蝇中, 不同地区的人群在不同温度下有不同的温度偏好、体型、发育时间、长寿、繁殖力和行走性能2 ,5,6,7。不同起源蝇之间的多样性由遗传变异和塑性基因表达8,9部分解释。同样, 不同区域的果蝇种类在温度梯度上分布不同, 并显示耐极端热和冷试验的差异10、11、12。

果蝇最近也成为了选择的模型, 了解温度知觉的遗传和神经基础13,14,15,16,17。一般来说, 成人苍蝇通过在天线和通过温度传感器在大脑13,14,15,16的冷和热外围温度传感器感知温度,17,18,19,20. 热温度的外围受体表示Gr28b16或发热21, 而外围冷受体的特征是Brivido14。在大脑中, 温度由表达TrpA115的神经元处理。对这些途径突变体的行为研究正在提高我们对温度如何处理的理解, 并对不同地区果蝇种群的变化机制进行深入的了解。

在这里, 我们描述一个温度控制的竞技场, 产生快速和精确的温度变化。调查人员可以对这些变化进行预编程, 这样就无需人工干预即可实现标准化和可重复的温度操纵。飞行记录和跟踪与专门的软件, 以确定他们的位置和速度在实验的不同阶段。本协议中提出的主要测量方法是在不同温度下的行走速度, 因为它是一种生态学相关的生理性能指标, 可识别个体的热适应性5。与温度受体突变体一起, 这种技术可以帮助揭示细胞和生化水平的热适应机制。

研究方案

1. 飞行食品培养基的制备

  1. 将 1 l 的自来水倒入2升玻璃杯中, 加入一个磁力搅拌棒。将烧杯放在300摄氏度的磁性热板上, 直到达到沸腾温度。
  2. 搅拌在500发/分钟, 并添加以下内容:10 克琼脂, 30 克葡萄糖, 15 克蔗糖, 15 克玉米粉, 10 克小麦胚芽, 10 克大豆面粉, 30 克糖蜜, 和 35 g 活性干酵母。
  3. 当混合泡沫剧烈时, 将热板温度降低到120摄氏度, 同时继续搅拌。
  4. 将热板温度进一步降低到30摄氏度后10分钟, 并继续搅拌, 直到混合冷却到48摄氏度。通过直接将温度计插入到食物中而不触及烧杯壁来测量温度。
  5. 将 2 g 的 p-羟基苯甲酸甲酯溶解成10毫升的96% 乙醇, 并加入到混合物中, 再加上5毫升的1米丙酸。持续搅拌3分钟。
  6. 关闭热板, 倒入45毫升的食物到饲养瓶和6.5 毫升的食物到收集瓶。

2. 苍蝇的制备

  1. 将20只雄性和20只雌性苍蝇放入含有45毫升苍蝇食品培养基的饲养瓶中。在3到4天后, 将苍蝇转到新瓶子, 然后点击它们, 然后敲击到新鲜的瓶子里。三更改后丢弃苍蝇。
    1. 将瓶子放在孵化器的12小时 light/12-h 暗循环下, 恒温温度为25摄氏度。
      注意: 新一代苍蝇将在十天后 eclose。
  2. 麻醉新 eclosed 在二氧化碳垫上飞行最多4分钟, 并收集他们在 2.5 x 9.5 厘米飞行饲养小瓶与6.5 毫升飞行食品培养基使用画笔。
    1. 收集只有处女苍蝇, 并把他们按性别分成20苍蝇每饲养小瓶组。
    2. 将小瓶放入孵化器5-7 天, 每2-3 天和实验前几天将苍蝇更换为新的小瓶。

3. 灯光框架

  1. 制作10厘米长、4厘米宽、4厘米高和0.5 厘米厚的木制框架。
  2. 在每个短边上, 创建4厘米长、4厘米高度和1.5 厘米宽的边框, 使其朝向木框架的内部区域。使边框的内部面保持打开状态。
  3. 在木框架的一个长边和短边的每个边界处, 钻出直径为0.5 厘米的两个孔。
  4. 在短边的每个边界内放置10厘米的暖白色 LED 条。剥下 LED 条的背面, 立即将其粘在原位。
    注意: 对于需要消除照明的实验, 可将暖白 led 条替换为红外线 led 条。
  5. 将 led 条的一端连接到开关电源及其另一端到相反边界的 led 条上。
  6. 打开开关电源以验证两个 LED 条是否打开。
  7. 用一张白色的纸盖住每个边框的开口面。
  8. 将另一张纸粘附到长边的每个内部阶段。

4. 温度控制竞技场

  1. 打开温度控制的竞技场 (图 1A和1C)。确保风扇开始运行, 铝环开始升温。
  2. 使用 USB 电缆将温度控制的竞技场连接到运行带有温度序列的TemperaturePhases脚本的控制计算机上。
  3. 在控制计算机中打开TemperaturePhases脚本, 并验证是否正确设置了温度序列 (视频 1)。
    1. 通过验证 "par", 检查每个实验阶段的持续时间是否设置为六十年代。StimulusDur "等于六十年代。
    2. 检查 1) 等于所需的相位数, 2) 迭代开/关设置的指示性红光发光二极管 (led), 3) 2 °c 每相温度升高, 和 4) 16 °c 作为启动温度所有正确下 "启动实验块 "部分。
      注意: 允许苍蝇适应飞行竞技场7分钟在16摄氏度, 以避免人为增加速度在第一个实验阶段 (图 2)。
    3. 运行TemperaturePhases脚本。该软件将初始化5秒, 在 "竞技场" 中确定。等待 "然后停止。
    4. 按下键盘的空格键开始运行实验阶段, 一旦苍蝇被吹入飞竞技场 (步骤 5.3)。
      注意: TemperaturePhases是当前控制方框的脚本;但是, 可以创建其他自定义脚本以使用此设备来适应不同实验的要求。
  4. 使用相机的 USB 电缆将竞技场顶部的摄像机连接到录制计算机。
  5. 在录制计算机中打开视频录制程序 (参见材料表), 选择 "文件 |新的电影录制 "。将会打开显示相机图像的屏幕。
    1. 确保相机图像捕获竞技场的所有边缘和指示性红色 led。
    2. 通过按屏幕底部边缘的红色按钮开始录制, 在舞台周围设置灯光帧后显示相机图像 (步骤 5.4)。
      注意: 光照的细微变化会影响跟踪的准确性。建议通过固定设备的位置来保持温度控制的竞技场恒定的照明。

5. 温度行为实验

  1. 准备飞行竞技场 (图 1C)。
    1. 将一束白色导电胶带放在铜砖的顶部, 确保覆盖所有边缘。
    2. 在铜砖周围放置加热铝环。环的边缘完全适合铜砖, 因此它总是放置在同一位置。
    3. 用干净的纸巾清洁玻璃盖, 把它放在铝环的顶部, 留下一个可以吹飞的缝隙。
      注意: 在实验前, 用渗硅剂涂上玻璃盖, 形成光滑的表面。应用渗硅剂24小时, 用清水冲洗。
  2. 运行TemperaturePhases脚本 (步骤 4.3.3) 并打开视频录制程序 (步骤 4.5)。
  3. 从饲养小瓶 (步 2.2.2) 吹飞到飞行竞技场 (如图 3中的1个雄蝇).
    1. 从孵化器中取出一小瓶苍蝇, 点击两次, 迫使它们进入底部, 用嘴吸引器一只苍蝇, 然后关闭小瓶并把它放回孵化器。
    2. 通过在玻璃罩和铝环之间留下的缝隙 (步骤 5.1.3) 将苍蝇放在竞技场上。
    3. 将玻璃盖和铝环之间的缝隙按下, 直到飞向飞行竞技场时, 它才到达铝环的边缘。
  4. 在竞技场周围放置灯光框以确保对称照明。
    1. 在飞行竞技场周围的灯光框架 (图 1C) 上标记位置 (例如, 使用永久标记), 以确保框架始终放置在同一位置。
  5. 使用视频录制程序 (步骤 4.5.2) 开始录制, 然后按控制计算机键盘上的空格键开始运行实验阶段 (步骤 4.3.4)。
  6. 完成所有实验阶段后, 请将视频保存在. mp4 或. avi 格式中, 然后用吸嘴的方式从飞行竞技场中移除苍蝇。
    注意: 实验阶段的结束可由指示性红色 led 指示灯关闭或TemperaturePhases脚本停止决定。
    1. 在录制程序中按屏幕底部边缘中间的 "停止" 按钮停止视频录制。按 "文件 |另存为 "保存视频。

6. 视频跟踪和数据分析

  1. 使用FlySteps跟踪软件 (视频 2) 跟踪视频。
    1. 在 "FlyTracker" 文件夹中打开 "configuration_file"。
    2. 在 "video_folder" 中设置视频的位置和 "video_files" 中视频的名称。
    3. 根据竞技场边缘多个点的 (x、y) 像素坐标, 指定 "arena_settings" 中的飞行竞技场的边框。
    4. 根据 led 中心位置的 (x、y) 像素坐标, 在 "led_settings" 中指定指示性红色 led 的位置。
    5. 通过在 "arena_settings" 中设置 "调试" 到 "true", 单击 "保存", 然后在终端运行脚本, 检查飞行竞技场的边界位置。视频的屏幕截图将以 "arena_settings" 中输入的坐标形成的蓝色正方形显示。
      注: 此正方形环绕要跟踪的区域。
    6. 更改 "调试" 在 "arena_settings" 到 "false", 单击 "保存", 并再次运行在终端屏幕。
      注意: 这将启动跟踪过程。
      注意: 苍蝇可以走出跟踪区域到加热铝环。这种情况发生在实验的第一秒, 之后苍蝇停止接触加热环并留在跟踪区域内。
      注意: 视频可以根据实验者的喜好跟踪其他跟踪软件。
  2. 使用跟踪软件提供的每只苍蝇的 (x,y) 位置来计算温度性能的利息测量值。可以使用自定义脚本 ( FlyStepsAnalysis 补充)。
  3. 使用统计软件 (参见材料表), 比较不同飞行组的温度性能曲线, 重复测量 (RM) 方差 (方差分析) 和后向多比较。

结果

温度控制的竞技场 (图 1A) 由三个铜瓦组成, 其温度可通过可编程电路单独控制。每块铜瓦都有一个温度传感器, 可以向可编程电路提供反馈。电路激活电源以增加每个磁贴的温度。被动式热电元件充当恒定的加热元件, 以保持所需的温度, 而风扇冷却的散热片提供恒定的冷却。温度变化的幅度以非线性的方式决定了过程的速度。增加2摄氏度只需要0.1 ?...

讨论

在这里, 我们提出了一个自动化的温度控制竞技场 (图 1), 在时间和空间上产生精确的温度变化。这种方法允许单独的果蝇暴露, 不仅是预先编程的逐渐增加的温度 (图 2和图 3), 但也对动态温度挑战, 其中每个瓷砖的飞行竞技场被加热独立于不同的温度 (图 4和 图 5)。

披露声明

作者声明他们没有竞争的经济利益。

致谢

这项工作部分由格罗宁根大学的行为和认知神经科学计划的奖学金和来自墨西哥的委员会 Ciencia y 国家 (国家科学技术委员会) 的研究生奖学金, 授予安德烈帕迪拉, 以及 Hedderik Rijn 和吉恩-克里斯托弗. 比耶泰的时间研究奖。我们也感谢彼得 Gerrit 峨参与开发FlySteps跟踪器。

脚本TemperaturePhases、FlySteps和FlyStepAnalysis可以被发现为补充信息, 并在以下临时和公开可用的链接:
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml？token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Arduino DueArduinoA000062Software RUG
Electronics BoardRuijsink Dynamic EngineeringFF-Main-02-2014
Power supply BoostXP-Power 48. V 65 WECS65US48Set to 53 Volt
Power supply Tile HeatingXP-Power 15. V 80 WVFT80US15
Power supply CoolingXP-Power 15. V 130 WECS130U515
Peltier elementsMarlow IndustriesRC12-42 Elements, controlled DC feed
Heat sinkFisher TechnikLA 9/150-230VDecoupled for vibration
Temperature sensorsMeasurement SpecialtiesMCD_10K3MCD1Micro Thermistor Probe
Copper block/tilesRuijsink Dynamic EngineeringFF-CB-01-2014
Auminum ringRuijsink Dynamic EngineeringFF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mmRS Components111-2300 White conductive tape
Red LEDsLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daWavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED stripLedstripkoningHQ-3528-SMD60 LEDs per meter
Switch Power SupplyGenericT-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTime PlayerApple ComputerRecording program
Tracking analysis softwareRPackages: pacman
Tracking analysis softwareMATLAB
Thermal ImagingFLIR T400sc
Graphs and Statisticts SoftwareGraph Pad Prism
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100MLSiliconising agent
Fly rearing bottlesFlystuff32-1306oz Drosophila stock bottle
FlypadFlystuff59-114
Fly rearing vialsDominique Dutscher789008Drosophila tubes narrow 25x95 mm
IncubatorSanyoMIR-154
Magnetic hot plateHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ingredients B.V.010001.26.0
GlucoseGezond&wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SucroseVan GilseGranulated sugar
CornmealFlystuff62-100
Wheat germGezond&wel1017683
Soy flourFlystuff62-115
MolassesFlystuff62-117
Active dry yeastRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%

参考文献

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