시간과 공간에서 온도 변화에 대 한 응답에서 초파리 의 성능을 결정 하는 자동화 된 방법

요약

여기 우리는 자동으로 시간과 공간에 신속 하 고 정확한 온도 변화를 생성 하는 프로그래밍 가능 온도 제어 경기장을 사용 하 여 온도 변화에 초파리 의 운동 성능을 결정 하는 프로토콜을 제시.

초록

온도 종 배포 하 고 작동 하는 방법에 영향을 미치는 유비쿼터스 환경 요소 이다. 초파리 초파리의 다른 종은 그들의 생리 적인 포용 력과 적응성에 따라 온도 변화에 대 한 특정 응답 있다. 초파리 파리 또한 온도 감지 온도 ectotherms에 처리의 신경 기초를 이해 하는 데 기본 되는 시스템을가지고. 선물이 여기 신속 하 고 정확한 온도 변화 온도 변화에 개별 응답을 탐험을 시간적, 공간적 제어를 허용 하는 온도 제어 경기장. 개별 파리는 경기장에 배치 하 고 균일 한 점진적 증가 반응 규범을 결정 하는 온도 또는 공간적으로 분산된 온도 환경 설정을 확인 하려면 동시에 같은 전에 미리 프로그램 된 온도, 노출. 개인 자동으로 추적, 속도 위치 기본 설정의 정량화를 허용 합니다. 이 메서드는 빠르게 다양 한 초파리 의 온도 성능 곡선을 결정 하는 온도 또는 유사한 크기의 다른 곤충 응답 척도를 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 온도 환경과 돌연변이 또는 야생-타입 파리의 반응 척도를 유전자 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 열 종 분화와 적응, 뿐만 아니라 온도 처리 뒤에 신경 메커니즘의 기초를 밝히기 도울 수 있습니다.

서문

온도 어떻게 유기 체 기능 및¹동작에 영향을 미치는 일정 한 환경 요소 이다. 위도 및 고도에 차이 유기 체 온도^2,3에 대 한 답변에 대 한 진화 선택이 결과에 노출 되는 기후의 유형에 차이 이어질. 유기 체는⁴그들의 특정 환경 성능을 극대화 하는 형태, 생리, 및 행동 적응을 통해 다른 온도에 응답. 예를 들어, 초파리 melanogaster과일 파리에서 다른 지역에서 인구는 다른 온도, 신체 크기, 개발 시간, 장 수, 통치, 환경과 걷는 성능 다른 온도^{2에 ,5,,67}. 다른 근원의 파리 사이 관찰 하는 다양성 유전 변이 및 플라스틱 유전자 식^8,9부분에서 설명 합니다. 마찬가지로, 다른 지역에서 초파리 종 다르게 온도 그라디언트 가운데 고 극단적인 열 및 감기 테스트^10,,1112에 저항에서 차이 보여.

초파리 도 최근 온도 인식^{13,14,15,,1617}의 유전과 신경 기초를 이해 하는 선택의 모델 되고있다. 성인 파리는 안테나에 춥고 뜨거운 주변 온도 센서를 통해 및 뇌^13,14,,1516 에 온도 센서를 통해 온도 인식 하는 광범위 하 게, ^{, 17 , 18 , 19 , 20}. 뜨거운 온도 대 한 주변 수용 체 Gr28b.d¹⁶ 또는 Pyrexia²¹표현, 주변 동안 찬 수용 체는 Brivido¹⁴특징. 뇌에서 온도 TrpA1¹⁵를 표현 하는 신경에 의해 처리 됩니다. 이 통로의 돌연변이에 행동 연구 온도 처리 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 개선 하 고 다른 지역에서 초파리 의 인구 가운데 다 메커니즘에 통찰력을 제공.

여기 우리는 신속 하 고 정확한 온도 변화를 일으키는 온도 제어 분야를 설명 합니다. 수 사관 프로그램 할 수 미리 이러한 변화, 인간의 개입 없이 표준화 하 고 반복 가능한 온도 조작에 대 한 수 있습니다. 파리는 기록 하 고 추적 하는 실험의 다른 단계에서 그들의 위치와 속도 결정 하기 위해 전문된 소프트웨어와 함께. 이 프로토콜에서 제시 하는 주요 측정 개별 열 적응성⁵를 식별할 수 있는 생리 적 성과의 생태학적으로 관련 색인 이기 때문에 다른 온도에 걷는 속도입니다. 온도 수용 체 돌연변이, 함께이 기술은 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 열 적응의 메커니즘을 밝힐 수. 있습니다

프로토콜

1입니다. 비행 음식 매체의 준비

1. 수돗물의 1 L 2 L 유리 비 커에 부 어 고 추가 자기 저 어 바. 비등 온도 도달할 때까지 비 커 300 ° C에 자기 뜨거운 접시에 넣어.
2. 500 발/분에 저 어 하 고 다음을 추가: 한 천 10 g, 포도의 30 g, 자당의 15 g, cornmeal의 15 g, 밀 세균의 10 g, 콩 가루 10 g, 당 밀의 30 g 및 활성 건조 효 모 35 g.
3. 때 혼합 foams 적극적으로, 거절 열판 온도 120 ° C를 교 반 하면서.
4. 10 분 후 열판 온도 30 ° C까지 추가 설정 하 고 교 반 혼합 48 ° c에 냉각 될 때까지 계속 비 커의 벽을 건드리지 않고 음식에 직접 온도계를 삽입 하 여 온도 측정 합니다.
5. P-hydroxy-benzoic 산 메 틸 에스테 르의 2 세대 96% 에탄올 10 mL에 녹이 고 1 M 프로 산의 5 mL와 함께 믹스에 추가. 3 분 교 반을 계속 합니다.
6. 핫 플레이트를 끄고 열이 양육 컬렉션 튜브에 음식의 6.5 mL 병으로 식품의 45 mL를 따르고.

2입니다. 파리의 준비

1. 장소 20 남성과 20 여성 비행 음식 매체의 45 mL를 포함 하는 양육 병에서 난다. 내려 그들을 도청 하 고 신선한 병으로 그들을 활용 하 여 새로운 병 3 ~ 4 일 후 파리 전송. 3 변경 후 파리를 버리십시오.
   1. 25 ° c 12 h 빛/12-h 어두운 주기에 일정 한 온도에서 인큐베이터 안에 병을 배치
      참고: 파리의 새로운 세대는 10 일 후 eclose를 것입니다.
2. Anesthetize 새로 이산화탄소 패드 4 분의 최대에 eclosed 파리 고 그림 붓을 사용 하 여 비행 음식 매체의 6.5 mL와 2.5 x 9.5 c m 비행 양육 튜브에서 그들을 수집 합니다.
   1. 만 처녀 파리를 수집 하 고 섹스에 의해 양육 유리병 당 20의 그룹으로 그들을 분리.
   2. 5-7 일, 새로운 튜브 2-3 일 마다 하 고 실험 하기 전에 일에 파리를 변경에 대 한 incubators 내부 튜브를 놓습니다.

3입니다. 빛의 구조

1. 10 cm 길이, 4 cm 폭, 4cm 높이 및 0.5 ㎝ 두께의 나무 프레임을 확인 합니다.
2. 각각의 짧은 가장자리, 4cm 길이, 높이 4 cm, 및 안쪽으로 1.5 c m 너비의 테두리를 만들 나무 프레임의 영역. 테두리의 내부 얼굴을 둡니다.
3. 0.5 cm 직경의 나무 프레임의 긴 가장자리 중 교차로에서 그리고 짧은 가장자리에 테두리의 각에서 두 구멍을 드릴 합니다.
4. 짧은 가장자리에 테두리의 각각 안에 따뜻한 백색 LED 스트립의 장소 10 cm. 즉시 자리에 접착제로 LED 스트립의 뒷면을 껍질.
   참고: 적외선 LED 돼야 하는 조명 요구에 따뜻한 백색 LED 스트립을 대체 하실 수 있습니다 하는 실험에 대 한 제거 합니다.
5. 스위칭 전원 공급 장치 및 그것의 다른 쪽 끝 반대 테두리에 LED 스트립 테두리 중 하나에 LED 스트립의 한쪽 끝을 연결 합니다.
6. 모두 LED 스트립 설정 확인 하려면 스위칭 전원 공급 장치를 켜십시오.
7. 종이의 백색 조각으로 각 테두리의 열린 측면을 커버.
8. 긴 가장자리의 내부 단계의 각 지의 다른 조각을 접착제.

4. 온도 제어 분야

1. 온도 제어 분야 (그림 1A 및 1c)을 켭니다. 알루미늄 링 워밍업 시작 팬 실행 됩니다 확인 하십시오.
2. 온도 제어 경기장 온도 시퀀스 TemperaturePhases 스크립트를 실행 하는 제어 컴퓨터에 연결 하는 USB 케이블을 사용 합니다.
3. 제어 컴퓨터에서 TemperaturePhases 스크립트를 열고 온도 시퀀스 (비디오 1)를 제대로 설정 되어 있는지 확인 합니다.
   1. 각 실험 단계 기간 60로 설정 된 검사는 "파 확인 하 여 s. StimulusDur "는 60 s.
   2. 1) 수와 같은 원하는 단계, 2) 반복 ON/OFF 표시 하는 빨간 빛 발광 다이오드 (Led), 위상, 당 3) 2 ° C 온도 증가 수 및 시작 온도 4) 16 ° C는 "시작 실험에서 모두 올바른지 확인 블록"섹션입니다.
      참고: 첫 번째 실험 단계 (그림 2) 속도의 인공 증가 피하기 위해 16 ° C에서 7 분 동안 비행 분야에 적응 하는 파리 수 있습니다.
   3. TemperaturePhases 스크립트를 실행 합니다. 소프트웨어 경기장"결정으로 5 초 동안 초기화. "고 중지입니다.
   4. 일단 비행 비행 아레나 (5.3 단계)으로 날 려 왔다 실험 단계를 실행 하려면 키보드의 스페이스바를 누릅니다.
      참고: TemperaturePhases 는 현재 스크립트 제어 상자; 그러나, 그것이 다른 실험의 요구를 조정 하는이 장치를 사용 하 여 다른 사용자 지정 스크립트를 만들 수 있습니다.
4. 카메라의 USB 케이블을 사용 하 여 녹음 컴퓨터에 경기장의 위에 카메라를 연결 합니다.
5. 비디오 녹화 프로그램 ( 재료의 표참조)을 선택 하 여 녹음/녹화 컴퓨터에서 "파일 | 새로운 영화 기록 "입니다. 카메라에서 이미지를 표시 하는 화면이 열립니다.
   1. 카메라 이미지 캡처 경기장 및 나타내는 빨간색 Led의 모든 모서리를 확인 합니다.
   2. 아레나 (단계 5.4) 주위 빛의 프레임 설정 되 면 카메라 이미지를 보여주는 스크린의 아래쪽 가장자리에 중간에 빨간 버튼을 눌러 녹음을 시작 합니다.
      참고: 조명에 작은 변화는 추적의 정확도 발생할 수 있습니다. 온도 제어 분야의 조명 기구의 위치를 고정 하 여 일정 한 유지 하는 것이 좋습니다.

5. 온도 행동 실험

1. 비행 아레나 (그림 1C)을 준비 합니다.
   1. 모든 가장자리는 포함 하는 보장 구리 타일 위에 흰색 전도성 테이프의 가닥을 놓습니다.
   2. 장소 구리 타일 주위 온수 알루미늄 반지. 링의 가장자리는 구리 타일 주위 완벽 하 게 맞는 그래서 그것은 항상 같은 위치에 배치 됩니다.
   3. 깨끗 한 티슈로 커버 유리를 청소 하 고는 파리에서 날 수 있는 격차를 떠나 알루미늄 링 위에 두십시오.
      참고: 실험을 하기 전에 미 끄 러운 표면을 만들 siliconizing 에이전트와 함께 유리 커버 코트. 24 h에 대 한 siliconizing 에이전트를 적용 하 고 사용 하기 전에 물으로 그것을 씻어.
2. TemperaturePhases 스크립트 (4.3.3 단계)를 실행 하 고 비디오 녹화 프로그램 (4.5 단계).
3. 비행 무대로 양육 유리병 (단계 2.2.2)에서 파리를 날 려 (예., 남성 1 비행 그림3에서).
   1. 인큐베이터에서 파리의 유리병, 아래쪽으로 입 흡 인기와 함께 한 비행 트랩 및 유리병 닫고 다시 인큐베이터에 넣어가 서 그들을 두 번 누릅니다.
   2. 유리 덮개와 알루미늄 반지 (단계 5.1.3) 사이 남아 있다 차이 통해 경기장에 비행을 놓습니다.
   3. 비행 비행 분야에 도입 되 자 마자 알루미늄 링의 가장자리에 도달할 때까지 유리 덮개를 밀어 유리 덮개와 알루미늄 반지 사이 간격을 닫습니다.
4. 대칭 조명 되도록 경기장 주위 빛의 프레임을 배치 합니다.
   1. 위치를 표시 (예., 영구 마커를 사용 하 여) 프레임 항상 같은 위치에 배치 되도록 보장 하기 위해 비행 아레나 (그림 1C) 주위 빛의 프레임의.
5. 비디오 녹화 프로그램 (4.5.2 단계)으로 녹음을 시작 하 고 실험 단계 (단계 4.3.4)를 실행 하려면 제어 컴퓨터의 키보드에서 스페이스바를 누릅니다.
6. 결국 실험 단계.mp4 또는.avi 포맷 비디오 저장 완료 되 고 입 흡 인기와 비행 경기장에서 파리를 제거 합니다.
   참고: TemperaturePhases 스크립트 중지 또는 모두 나타내는 빨간색 led가 해제 되 고 의해 실험 단계 끝을 확인할 수 있습니다.
   1. 비디오 레코딩 프로그램에서 화면의 아래쪽 가장자리의 중간에 중지 버튼을 누르면 녹화를 중지 합니다. 언론 "파일 | 다른 이름으로 저장"비디오를 하기.

6. 비디오 추적 및 데이터 분석

1. FlySteps 추적 소프트웨어 (동영상 2)를 사용 하 여 동영상을 추적.
   1. "FlyTracker" 폴더 안에 "configuration_file.ini"를 엽니다.
   2. "Video_folder"에서 동영상의 위치 및 "video_files"에 동영상의 이름을 설정 합니다.
   3. "Arena_settings"에 따라 비행 아레나의 테두리를 지정 (x, y)는 경기장의 가장자리에 여러 점의 픽셀 좌표.
   4. "Led_settings"에 따라 나타내는 빨간색 Led의 위치 지정 (x, y) Led의 중심의 위치를 픽셀 좌표.
   5. 체크인 비행 아레나의 국경의 위치 "디버그"를 설정 하 여 "true"로 "arena_settings", "저장"을 클릭 하 고 터미널에서 스크립트를 실행 합니다. 비디오의 화면 캡처는 "arena_settings"에 입력 된 좌표에 의해 형성 된 파란색 사각형으로 표시 됩니다.
      참고:이 사각형 영역 추적을 포위 한다.
   6. "False"로 "arena_settings"에서 "디버그"을 변경 하 고 "저장"을 클릭 한 터미널에서 화면을 한 번 더 실행.
      참고:이 추적 프로세스를 시작 합니다.
      참고: 파리 온수 알루미늄 반지에 추적 영역 밖으로 걸을 수 있습니다. 이 후 파리 온수 반지를만 지 중지 하 고 추적 영역 내부 유지 실험의 첫 번째 초 동안 발생 합니다.
      참고: 비디오는 실험의 기본 설정에 따라 다른 추적 소프트웨어와 함께 추적할 수 있습니다.
2. 사용 (x, y)의 각 온도 성능에 대 한 관심의 계산에 추적 소프트웨어에 의해 제공 된 위치. 사용자 지정 스크립트 (예., FlyStepsAnalysis 보충에) 사용할 수 있습니다.
3. 비교를 사용 하 여 반복된 측정 (RM) 분산 분석 (ANOVA) 및 게시물-임시 통계 소프트웨어를 사용 하 여 여러 비교 다른 비행 그룹의 온도 성능 곡선 ( 재료의 표참조).

결과

3 구리 타일의 온도 개별적으로 프로그래밍 가능한 회로 통해 통제 될 수 있다 (그림 1A) 온도 제어 분야에 의하여 이루어져 있다. 각 구리 타일 프로그래밍 가능한 회로 피드백을 제공 하는 온도 센서를가지고 있습니다. 회로 전원 공급 장치 각 타일의 온도 증가를 활성화 합니다. 수동 열전 요소는 팬에 의해 냉각 방열판 일정 한 냉각을 제공 하는 동?...

토론

여기 우리는 자동된 온도 제어 아레나 (그림 1) 시간과 공간에 정확한 온도 변화를 일으키는 제시. 이 방법을 사용 하면 개별 초파리 의 온도 (그림 2 및 그림 3), 미리 프로그램 된 점진적 증가 뿐만 아니라 동적 온도 전에 비행 분야의 각 도와 열 되었다 노출 다른 온도에 독립적으로 (그림 4 및

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Due	Arduino	A000062	Software RUG
Electronics Board	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-Main-02-2014
Power supply Boost	XP-Power 48. V 65 W	ECS65US48	Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating	XP-Power 15. V 80 W	VFT80US15
Power supply Cooling	XP-Power 15. V 130 W	ECS130U515
Peltier elements	Marlow Industries	RC12-4	2 Elements, controlled DC feed
Heat sink	Fisher Technik	LA 9/150-230V	Decoupled for vibration
Temperature sensors	Measurement Specialties	MCD_10K3MCD1	Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-CB-01-2014
Auminum ring	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm	RS Components	111-2300	White conductive tape
Red LEDs	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip	Ledstripkoning	HQ-3528-SMD	60 LEDs per meter
Switch Power Supply	Generic	T-36-12
Logitech c920	Logitech Europe S.A	PN960-001055
QuickTime Player	Apple Computer		Recording program
Tracking analysis software	R		Packages: pacman
Tracking analysis software	MATLAB
Thermal Imaging	FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software	Graph Pad Prism
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML	Siliconising agent
Fly rearing bottles	Flystuff	32-130	6oz Drosophila stock bottle
Flypad	Flystuff	59-114
Fly rearing vials	Dominique Dutscher	789008	Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator	Sanyo	MIR-154
Magnetic hot plate	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic Ingredients B.V.	010001.26.0
Glucose	Gezond&wel	1019155	Dextrose/Druivensuiker
Sucrose	Van Gilse		Granulated sugar
Cornmeal	Flystuff	62-100
Wheat germ	Gezond&wel	1017683
Soy flour	Flystuff	62-115
Molasses	Flystuff	62-117
Active dry yeast	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%