Une méthode automatisée pour déterminer la Performance de la drosophile en réponse aux changements de température dans l’espace et le temps

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour déterminer automatiquement la performance locomotrice de la drosophile aux changements de température à l’aide d’une arène programmable à température contrôlée qui produit des changements de température rapide et précis dans le temps et l’espace.

Résumé

Température est un facteur environnemental omniprésent qui influe sur les espèces distribuent et se comportent. Différentes espèces de mouches à fruit drosophile ont des réponses concrètes aux changements de température selon leur tolérance physiologique et l’adaptabilité. Drosophile mouches possèdent également un système devenu fondamentale pour comprendre les bases neurales de la température de transformation en ectothermes thermosensibles. Nous présentons ici une arène à température contrôlée qui permet des changements de température rapides et précis avec contrôle temporel et spatial pour étudier la réponse de mouches individuels aux changements de température. Les mouches individuels sont placés dans l’arène et exposées aux températures préprogrammées défis, tel que progressive uniforme augmente de température pour déterminer les normes de réaction ou de températures distribuées spatialement en même temps afin de déterminer les préférences. Les personnes sont suivies automatiquement, ce qui permet la quantification de la vitesse ou l’emplacement de préférence. Cette méthode permet de quantifier rapidement la réponse sur une large gamme de températures afin de déterminer les courbes de performance de température chez la drosophile ou d’autres insectes de la même taille. En outre, il peut être utilisé pour des études génétiques pour quantifier les préférences de la température et les réactions des mutants ou mouches de type sauvage. Cette méthode peut aider à découvrir la base de la spéciation thermique et adaptation, ainsi que les mécanismes neuronaux derrière la transformation de la température.

Introduction

La température est un facteur environnemental constant qui influe sur les organismes fonctionnent et comportent¹. Différences de latitude et altitude conduisent à des différences dans le type de climats organisme sont exposés, qui se traduit par une sélection évolutive pour leurs réponses à température^2,3. Organismes réagissent à différentes températures moyennant des adaptations morphologiques, physiologiques et comportementales qui maximisent le rendement dans leurs environnements particuliers⁴. Par exemple, chez la drosophile Drosophila melanogaster, les populations des différentes régions ont préférences de température différente, dimensions corporelles, developmental fois, longévité, fécondité et performance marche à différentes températures^{2 ,5,6,7}. La diversité observée entre les mouches d’origines différentes s’explique en partie par la variation génétique et expression de gène en plastique^8,9. De même, Drosophila espèces provenant de régions différentes répartir différemment entre les gradients de température et montrent les différences de résistance à la chaleur extrême et essais de froid^10,11,12.

Drosophile est récemment devenu le modèle de choix pour comprendre les bases génétiques et neurales de température perception^{13,14,15,16,17}. De façon générale, les mouches adultes perçoivent la température par le biais de capteurs de température périphérique chauds et froids dans les antennes et capteurs de température dans le cerveau^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. les récepteurs de la périphérie pour les températures chaudes expriment Gr28b.d¹⁶ ou²¹de la pyrexie, tandis que la périphérie froides récepteurs sont caractérisés par des Brivido¹⁴. Dans le cerveau, la température est traitée par les neurones exprimant TrpA1¹⁵. Des études comportementales sur les mutants de ces voies sont améliorent notre compréhension de la façon dont la température est traitée et donnent un aperçu des mécanismes qui diffèrent entre les populations de Drosophila provenant de différentes régions.

Nous décrivons ici une arène à température contrôlée qui produit des changements de température rapides et précis. Les enquêteurs peuvent préprogrammer ces changements, qui permet des manipulations de température standardisées et reproductibles sans intervention humaine. Les mouches sont enregistrés et suivis avec un logiciel spécialisé pour déterminer leur position et leur vitesse à différentes phases d’une expérience. La principale mesure présentée dans le présent protocole est la vitesse de marche à des températures différentes, parce que c’est un indice écologiquement pertinent de performance physiologique qui permet d’identifier une adaptabilité thermique individuel⁵. Ainsi que des mutants de récepteur de température, cette technique peut aider à révéler les mécanismes d’adaptation thermique aux niveaux cellulaires et biochimiques.

Protocole

1. préparation du milieu alimentaire mouche

1. Verser 1 L d’eau du robinet dans un bécher de verre de 2 L et ajouter un magnétique. Placer le bécher sur une plaque chauffante magnétique à 300 ° C jusqu'à ce que la température d’ébullition est atteinte.
2. Remuer à 500 tours/min et ajoutez le code suivant : 10 g d’agar, 30 g de glucose, 15 g de saccharose, 15 g de semoule de maïs, 10 g de germe de blé, 10 g de farine de soja, 30 g de mélasse et 35 g d’active levure sèche.
3. Lorsque le mélange des mousses vigoureusement, baissez la température de la plaque de cuisson à 120 ° C tout en continuant de remuer.
4. Tourner à la température de la plaque chauffante plus loin jusqu'à 30 ° C après 10 min et continuer à remuer jusqu'à ce que le mélange refroidisse à 48 ° C. Mesurer la température en insérant un thermomètre directement dans la nourriture sans toucher les parois du bécher.
5. Dissoudre 2 g d’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-benzoïque dans 10 mL d’éthanol à 96 % et ajoutez-le au mélange, avec 5 mL d’acide propionique de 1 M. Continuer à remuer pendant 3 min.
6. Éteindre la plaque chauffante et versez 45 mL d’aliment dans les bouteilles et les 6,5 mL d’aliment dans les flacons de collection d’élevage.

2. préparation des mouches

1. Place 20 garçons et 20 filles vole dans les bouteilles d’élevage contenant 45 mL de milieu de nourriture volée. Transférer les mouches de nouvelles bouteilles après 3 à 4 jours en tapant dessus vers le bas et puis les puiser dans les bouteilles fraîches. Jeter les mouches après trois changements.
   1. Placer les bouteilles à l’intérieur de l’incubateur cycles sombres de lumière/12 h 12 h avec une température constante de 25 ° C.
      Remarque : Une nouvelle génération de mouches seront eclose après dix jours.
2. Anesthésier nouvellement éclos de mouches sur des tampons en dioxyde de carbone pour un maximum de 4 min et à leur rassemblement dans des flacons d’élevage mouche de 2,5 x 9,5 cm 6,5 ml de milieu de nourriture volée à l’aide d’un pinceau.
   1. Recueillir les mouches seulement vierges et séparez-les par sexe en groupes de 20 mouches par flacon d’élevage.
   2. Placer les flacons à l’intérieur des incubateurs pendant 5 à 7 jours, changeant les mouches de nouveaux flacons tous les 2-3 jours et les jours précédant les expériences.

3. cadre de lumières

1. Faire un cadre en bois de 10 cm de long, largeur 4 cm, hauteur 4 cm et 0,5 cm d’épaisseur.
2. Sur chacun des bords courts, créer une bordure de 4 cm de long, 4 cm de hauteur et largeur de 1,5 cm vers l’intérieur zone du cadre en bois. Laissez la face interne de l’ouverture de la frontière.
3. Percer deux trous de 0,5 cm de diamètre à l’intersection de l’un des bords longs de l’armature en bois et à chacune des frontières sur les bords courts.
4. Placer 10 cm d’une bande de LED blanche chaude à l’intérieur de chacune des frontières sur les bords courts. Peler le dos de la bande de LED à coller immédiatement en place.
   Remarque : Pour des expériences en quel illumination doit être éliminé, la bande de LED blanche chaude peut être substituée à LED infrarouge bandes.
5. Connectez une extrémité de la bande de LED dans l’une des frontières de l’alimentation à découpage et son autre extrémité de la bande de LED au bord opposé.
6. Allumez l’alimentation à découpage pour vérifier que les deux bandes de LED s’allume.
7. Couvrir le côté ouvert de chaque frontière avec une feuille blanche de papier.
8. Collez un autre morceau de papier sur chacune des phases internes longitudinal.

4. température contrôlée Arena

1. Allumez l’arène à température contrôlée (Figure 1 a et 1C). S’assurer que le ventilateur se met en marche et l’anneau en aluminium commence à réchauffer.
2. Utilisez un câble USB pour connecter l’arène à température contrôlée pour l’ordinateur exécutant le script TemperaturePhases avec des séquences de température.
3. Ouvrez le script TemperaturePhases dans l’ordinateur et vérifiez que la séquence de température est correctement mises en place (vidéo 1).
   1. Vérifiez que la durée de chaque phase expérimentale est réglée à 60 s en vérifiant que « au pair. StimulusDur » est égal à 60 s.
   2. Vérifiez que le numéro 1) égal à désiré nombre de phases, 2) itératifs marche/arrêt réglage de la lumière rouge indicative des diodes électroluminescentes (del), augmentation de la température 3) 2 ° C par phase, et 4) 16 ° C sous la température de départ sont toutes correctes dans le « démarrer l’expérimental section de bloc ».
      Remarque : Laissez les mouches s’acclimater à l’aréna de voler pendant 7 min à 16 ° C afin d’éviter une augmentation artificielle de la vitesse au cours des premières phases expérimentales (Figure 2).
   3. Exécutez le script TemperaturePhases . Le logiciel s’initialise pendant 5 secondes, selon la définition de « arena. Wait » et puis arrêter.
   4. Appuyez sur la barre d’espace du clavier pour commencer à exécuter les phases expérimentales, une fois qu’une mouche a été soufflée dans l’arène de voler (étape 5.3).
      Remarque : Le TemperaturePhases est le script courant, contrôle de la boîte ; Toutefois, il est possible de créer d’autres scripts personnalisés pour utiliser ce dispositif qui s’ajustent aux besoins des différentes expériences.
4. Connectez la caméra sur le dessus de l’arène à l’ordinateur de l’enregistrement à l’aide du câble USB de la caméra.
5. Ouvrez le programme d’enregistrement vidéo (voir Table des matières) dans l’ordinateur de l’enregistrement en sélectionnant « fichier | Nouvel enregistrement de film ». Un écran affichant l’image de la caméra s’ouvrira.
   1. Veiller à ce que l’image de la caméra capte tous les bords de l’arène et les LEDs rouges indicatives.
   2. Démarrer l’enregistrement en appuyant sur le bouton rouge au milieu de la partie inférieure de l’écran montrant l’image de la caméra après avoir réglé l’armature de lumières autour de l’arène (étape 5.4).
      NOTE : petits changements dans l’éclairage peut affecter la précision de la localisation. Il est recommandé de maintenir l’éclairage de l’arène de contrôle de la température constante en fixant l’emplacement de l’appareil.

5. la température des expériences comportementales

1. Préparer la mouche Arena (Figure 1).
   1. Mettez un brin d’auto-ADHESIF blanc sur le dessus les tuiles en cuivre, assurant que tous les bords sont couverts.
   2. Placez l’anneau d’aluminium chauffée autour des tuiles de cuivre. Le bord de l’anneau s’adapte autour des tuiles en cuivre donc il est toujours placé au même endroit.
   3. Nettoyer le couvercle en verre avec un tissu propre et placez-le sur le dessus de l’anneau en aluminium, en laissant un espace à travers lequel une mouche peut être soufflée dans.
      Remarque : Avant les expériences, recouvrir le couvercle en verre avec l’agent siliconizing pour créer une surface glissante. Appliquer l’agent siliconizing pour 24h et rincez-le à l’eau avant utilisation.
2. Exécutez le script TemperaturePhases (étape 4.3.3) et ouvrez le programme d’enregistrement vidéo (étape 4.5).
3. Souffler la volée d’un flacon d’élevage (étape 2.2.2) dans l’arène de voler (e.g., 1 mâle à la mouche dans la Figure 3).
   1. Prendre un flacon de mouches de l’incubateur, touchez deux fois pour les forcer à aller vers le bas, piéger une mouche avec un aspirateur à bouche et fermer le flacon et remettez-le dans l’incubateur.
   2. Placez la mouche sur la scène par le biais de l’écart qui a été laissé entre le couvercle en verre et anneau en aluminium (étape 5.1.3).
   3. Combler le fossé entre le couvercle en verre et anneau en aluminium en appuyant sur le couvercle en verre jusqu'à ce qu’elle atteigne le bord de l’anneau en aluminium dès que la mouche est introduite dans l’arène de voler.
4. Placer le cadre de lumières autour de l’arène afin d’assurer l’éclairage symétrique.
   1. Marquer l’emplacement (p. ex.., à l’aide d’un marqueur permanent) de la trame de lumières autour de l’arène de voler (Figure 1) pour s’assurer que le cadre est toujours placé au même endroit.
5. Démarrer l’enregistrement avec le programme d’enregistrement vidéo (étape 4.5.2) et appuyez sur la barre d’espacement du clavier de l’ordinateur de contrôle pour commencer à exécuter les phases expérimentales (étape 4.3.4).
6. Phases expérimentales après tout terminés, enregistrer la vidéo au format .mp4 ou .avi et retirer la mouche de l’arène de voler avec l’aspirateur de la bouche.
   Remarque : La fin des phases expérimentales peut être déterminée par les deux LEDs rouges indicatifs étant éteints ou par l’arrêt du script TemperaturePhases .
   1. Arrêter l’enregistrement vidéo en appuyant sur le bouton arrêter au milieu du bord inférieur de l’écran dans le programme d’enregistrement. Appuyez sur « fichier | Enregistrer sous » pour enregistrer la vidéo.

6. lunette Digital video suivi et analyse des données

1. Utiliser le FlySteps dépistant le logiciel (vidéo 2) pour suivre les vidéos.
   1. Ouvrez le « fichier_configuration.ini » dans le dossier « FlyTracker ».
   2. Définir l’emplacement des vidéos en « video_folder » et les noms des vidéos en « video_files ».
   3. Spécifier les frontières de l’arène de voler en « arena_settings », basé sur (x, y) coordonnées en pixels de plusieurs points au bord de l’arène.
   4. Spécifier l’emplacement des LEDs rouges indicatives dans « led_settings », basé sur (x, y) coordonnées en pixels de l’emplacement du centre de la LED.
   5. Vérifiez l’emplacement des frontières de l’arène de voler en définissant « debug » à « true » dans « arena_settings », en cliquant sur « Enregistrer » et exécuter le script dans le terminal. Une capture d’écran de la vidéo s’affiche avec un carré bleu formé par les coordonnées saisies dans « arena_settings ».
      Remarque : Cette place entoure la zone à être l’objet d’un suivi.
   6. Changer « debug » dans « arena_settings » à « false », cliquez sur « Enregistrer » et exécutez l’écran dans le terminal une fois de plus.
      NOTE : Ceci va commencer le processus de suivi.
      Remarque : Les mouches peuvent marcher hors de la zone de suivi sur l’anneau en aluminium chauffée. Cela se produit pendant les premières secondes d’une expérience, après quoi les mouches cesser de toucher l’anneau chauffée et restent à l’intérieur de la zone de suivi.
      Remarque : Les vidéos peuvent être suivis avec d’autres logiciels de suivi selon les préférences de l’expérimentateur.
2. Utilisation (x, y) emplacement de chaque volée fournie par le logiciel de suivi pour calculer la mesure de l’intérêt pour l’exécution de la température. Scripts personnalisés (par exemple., FlyStepsAnalysis en supplémentaires) peut être utilisé.
3. Comparer les courbes de performances de température des différents groupes de voler à l’aide de mesures répétées (RM) analyse de la variance (ANOVA) et post-hoc des comparaisons multiples à l’aide de logiciels statistiques (voir Table des matières).

Résultats

L’arène à température contrôlée (Figure 1 a) se compose de trois tuiles de cuivre dont la température peut être contrôlée individuellement grâce à un circuit programmable. Chaque tuile cuivre possède un capteur de température qui donne une rétroaction au circuit programmable. Le circuit déclenche une alimentation pour augmenter la température de chaque tuile. Des éléments thermo-électriques passives agissent comme des éléments de chauff...

Discussion

Ici, nous avons présenté une automatisé thermorégulées arène (Figure 1) qui produit des changements de température précis dans le temps et l’espace. Cette méthode permet d’exposition individuelle drosophile non seulement préprogrammé augmentation progressive de la température (Figure 2 et Figure 3), mais aussi aux défis de température dynamique où chaque carreau de l’arène de mouche a été chauffé in...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Due	Arduino	A000062	Software RUG
Electronics Board	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-Main-02-2014
Power supply Boost	XP-Power 48. V 65 W	ECS65US48	Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating	XP-Power 15. V 80 W	VFT80US15
Power supply Cooling	XP-Power 15. V 130 W	ECS130U515
Peltier elements	Marlow Industries	RC12-4	2 Elements, controlled DC feed
Heat sink	Fisher Technik	LA 9/150-230V	Decoupled for vibration
Temperature sensors	Measurement Specialties	MCD_10K3MCD1	Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-CB-01-2014
Auminum ring	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm	RS Components	111-2300	White conductive tape
Red LEDs	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip	Ledstripkoning	HQ-3528-SMD	60 LEDs per meter
Switch Power Supply	Generic	T-36-12
Logitech c920	Logitech Europe S.A	PN960-001055
QuickTime Player	Apple Computer		Recording program
Tracking analysis software	R		Packages: pacman
Tracking analysis software	MATLAB
Thermal Imaging	FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software	Graph Pad Prism
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML	Siliconising agent
Fly rearing bottles	Flystuff	32-130	6oz Drosophila stock bottle
Flypad	Flystuff	59-114
Fly rearing vials	Dominique Dutscher	789008	Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator	Sanyo	MIR-154
Magnetic hot plate	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic Ingredients B.V.	010001.26.0
Glucose	Gezond&wel	1019155	Dextrose/Druivensuiker
Sucrose	Van Gilse		Granulated sugar
Cornmeal	Flystuff	62-100
Wheat germ	Gezond&wel	1017683
Soy flour	Flystuff	62-115
Molasses	Flystuff	62-117
Active dry yeast	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%