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Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.

Resumo

A temperatura é um fator ambiental onipresente que afeta como espécie distribuir e se comportar. Diferentes espécies de moscas de fruta Drosophila tem respostas específicas às mudanças de temperaturas, de acordo com sua tolerância fisiológica e adaptabilidade. Drosófila moscas também possuem uma sistema que se tornou fundamental para entender a base neural da temperatura de processamento na aditividade de sensores de temperatura. Apresentamos aqui uma arena de temperatura controlada que permite mudanças de temperatura rápida e precisa com controle temporal e espacial para explorar a resposta de moscas individuais às mudanças de temperaturas. Moscas individuais são colocadas na arena e expostas aos desafios de temperatura pré-programada, tais como uniforme gradual aumenta de temperatura a determinar normas de reação ou temperaturas espacialmente distribuídas ao mesmo tempo para determinar as preferências. Os indivíduos são controlados automaticamente, permitindo a quantificação da velocidade ou local de preferência. Esse método pode ser usado para quantificar rapidamente a resposta sobre uma vasta gama de temperaturas para determinar as curvas de desempenho de temperatura em Drosophila ou outros insetos de tamanho similar. Além disso, pode ser usada para estudos genéticos para quantificar a temperatura preferências e reações de mutantes ou selvagem-tipo moscas. Esse método pode ajudar a descobrir a base da especiação térmica e adaptação, bem como os mecanismos neurais subjacentes processamento de temperatura.

Introdução

A temperatura é um factor ambiental constante que afeta como organismos funcionam e se comportar1. As diferenças de latitude e altitude levam a diferenças no tipo de climas organismo são expostos, que resulta na seleção evolutiva para suas respostas a temperatura2,3. Os organismos respondem a temperaturas diferentes, através de adaptações morfológicas, fisiológicas e comportamentais que maximizar o desempenho sob seus determinados ambientes4. Por exemplo, na mosca da fruta Drosophila melanogaster, populações de diferentes regiões têm preferências de temperatura diferentes, tamanhos de corpo, vezes no desenvolvimento, longevidade, fecundidade e ambulante de desempenho em temperaturas diferentes2 ,5,6,7. A diversidade observada entre moscas de diferentes origens é explicada em parte pela variação genética e expressão de gene plástico8,9. Da mesma forma, espécies de Drosophila , de diferentes áreas distribuem diferentemente entre gradientes de temperatura e mostram as diferenças na resistência a calor extremo e frio testes10,11,12.

Drosófila recentemente também se tornou o modelo de escolha para entender a base genética e neural de temperatura percepção13,14,15,16,17. Em geral, moscas adultas percebem a temperatura através de sensores de temperatura periférica quentes e frias nas antenas e sensores de temperatura no cérebro14,13,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. os receptores da periferia para temperaturas quentes expressam Gr28b.d16 ou pirexia21, enquanto a periferia frios receptores são caracterizados por Brivido14. No cérebro, a temperatura é processada por neurônios expressando TrpA115. Estudos comportamentais em mutantes destas vias estão a melhorar a nossa compreensão de como a temperatura é processada e dar insights sobre mecanismos que variam entre as populações de Drosophila de diferentes regiões.

Aqui nós descrevemos uma arena de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápida e precisa. Investigadores podem pré-programar estas mudanças, o que permite manipulações de temperatura padronizados e repetíveis, sem intervenção humana. Moscas são registradas e controladas com software especializado para determinar sua posição e velocidade em diferentes fases de uma experiência. A principal medida apresentada neste protocolo é a velocidade ambulante em temperaturas diferentes, porque é um índice ecologicamente relevante de desempenho fisiológico que pode identificar a adaptabilidade individual térmico5. Juntamente com os mutantes do receptor de temperatura, esta técnica pode ajudar a revelar os mecanismos de adaptação térmica nível celular e bioquímico.

Protocolo

1. preparação da comida de mosca médio

  1. Despeje 1 L de água da torneira em um béquer de vidro de 2 L e adicionar uma barra de agitação magnética. Coloque o copo sobre uma chapa quente magnética a 300 ° C até a temperatura de ebulição é atingida.
  2. Mexa em 500 rodadas/min e adicione o seguinte: 10 g de ágar-ágar, 30 g de glicose, 15 g de sacarose, 15 g de farinha de milho, 10 g de germe de trigo, 10 g de farinha de soja, 30 g de melaço e 35 g de ativo fermento seco.
  3. Quando a mistura espumas vigorosamente, abaixe a temperatura da placa quente até 120 ° C, continuando a mexer.
  4. Vire ainda mais a prato quente temperatura até 30 ° C após 10 min e continue mexendo até a mistura esfria a 48 ° C. Medir a temperatura através da inserção de um termômetro diretamente na comida sem tocar as paredes do copo.
  5. Dissolver 2 g de éster metílico de ácido p-hidroxi-benzoico em 10 mL de etanol a 96% e adicioná-lo à mistura, juntamente com 5 mL de ácido propiônico de 1m. Continue mexendo por 3 min.
  6. Desligue a chapa e despeje a criação garrafas e 6,5 mL de alimento para os coleção de frascos 45 mL de alimento.

2. preparação de moscas

  1. Lugar de 20 machos e 20 fêmeas voa nas garrafas criação contendo 45 mL de meio de comida de mosca. Transferi as moscas para garrafas de novas depois de 3 a 4 dias tocar-lhes para baixo e tocando-os nas garrafas frescas. Descarte as moscas após três alterações.
    1. Coloque as garrafas dentro da incubadora sob ciclos de escuros luz/12-h 12-h com uma temperatura constante de 25 ° C.
      Nota: Uma nova geração de moscas será eclose depois de dez dias.
  2. ANESTHETIZE recém eclosed moscas em pastilhas de dióxido de carbono por um período máximo de 4 min e cobrá-los em frascos de criação voar 2.5 x 9.5 cm com 6,5 mL de meio de voar comida usando um pincel.
    1. Recolher a única virgens moscas e separá-los por sexo em grupos de 20 moscas por frasco de criação.
    2. Coloque os frascos dentro de incubadoras para 5-7 dias, mudando as moscas para novos frascos cada 2-3 dias e os dias antes de experimentos.

3. quadro de luzes

  1. Fazer uma moldura de madeira de 10 cm de comprimento, 4 cm de largura, 4 cm de altura e 0,5 cm de espessura.
  2. Em cada uma das arestas curtas, crie uma borda de 4 cm de comprimento, 4 cm de altura e largura de 1,5 cm para dentro área do frame de madeira. Deixe a face interna do fronteira aberta.
  3. Dois furos de 0,5 cm de diâmetro no cruzamento de uma das bordas da moldura de madeira longas e em cada uma das fronteiras nas extremidades curtas.
  4. Lugar de 10 cm de uma faixa de LED branca quente dentro de cada uma das fronteiras nas bordas curtas. Descasque a volta da faixa de LED para cola-lo imediatamente no lugar.
    Nota: Para experimentos em que iluminação precisa ser eliminada, a faixa de LED branca quente pode ser substituída por LED infravermelho tiras.
  5. Conecte uma extremidade da faixa de LED em uma das fronteiras para a alimentação e a outra extremidade à faixa de LED na borda oposta.
  6. Ligue a interruptor de alimentação para verificar que as duas tiras de LED acender.
  7. Cobrir o lado aberto de cada fronteira com um pedaço de papel branco.
  8. Cole um outro pedaço de papel para cada uma das fases internas das bordas longas.

4. temperatura controlada Arena

  1. Transformar a arena de temperatura controlada (figura 1A e 1C). Certifique-se que o ventilador começa a funcionar e o anel de alumínio começa a aquecer.
  2. Use um cabo USB para conectar a arena de temperatura controlada para o computador de controle executando o script TemperaturePhases com as sequências de temperatura.
  3. Abra o script TemperaturePhases no computador de controle e verifique se a sequência de temperatura está corretamente configurada (vídeo 1).
    1. Verifique se a duração de cada fase experimental é definida como 60 s verificando esse "par. StimulusDur"é igual a 60 s.
    2. Verifique se o número 1) igual ao desejado número de fases, 2) iterativos ON/OFF set-up a luz vermelha indicativa, emitindo-se diodos (LEDs), aumento de temperatura 3) 2 ° C por fase, e 4) 16 ° C, como a temperatura inicial estão todos corretos sob a "iniciar o experimental bloco"seção.
      Nota: Permitir que as moscas se adaptar à Arena voar por 7 min a 16 ° C para evitar um aumento artificial da velocidade durante as primeiras fases experimentais (Figura 2).
    3. Execute o script TemperaturePhases . O software irá inicializar durante 5 segundos, conforme determinado no "arena. Esperar"e depois parar.
    4. Pressione a barra de espaço do teclado para começar a executar as fases experimentais, uma vez que uma mosca foi destruída para a Arena de voar (etapa 5.3).
      Nota: O TemperaturePhases é o atual script controlando a caixa; no entanto, é possível criar outros scripts personalizados para usar este dispositivo que se ajustam às necessidades de diferentes experiências.
  4. Conecte a câmera em cima da arena para o gravação de computador usando o cabo USB da câmera.
  5. Abra o programa de gravação de vídeo (consulte Tabela de materiais) em gravação de computador, selecionando "arquivo | Nova gravação de filme". Abrirá uma tela mostrando a imagem da câmera.
    1. Certifique-se de que a imagem da câmera capta todas as bordas da arena e os LEDs vermelhos indicativos.
    2. Inicie a gravação, pressionando o botão vermelho no meio da borda inferior da tela, mostrando a imagem da câmera, uma vez que o quadro de luzes é definido em torno da arena (passo 5.4).
      Nota: pequenas mudanças na iluminação pode afetar a precisão de rastreamento. É aconselhável manter a iluminação da arena temperatura controlada constante ao fixar a localização do aparelho.

5. temperatura experimentos comportamentais

  1. Prepare a Arena mosca (Figura 1).
    1. Coloque um fio de fita condutora branco na parte superior das telhas de cobre, garantindo que todas as bordas são cobertas.
    2. Coloque o anel de alumínio aquecido em torno das telhas de cobre. A borda do anel se encaixa perfeitamente em torno das telhas de cobre para isso sempre é colocado no mesmo local.
    3. Limpe a tampa de vidro com um tecido limpo e coloque-o na parte superior do anel de alumínio, deixando uma abertura através da qual uma mosca pode ser levada em.
      Nota: Antes dos experimentos, revesti a tampa de vidro com o agente siliconizing para criar uma superfície escorregadia. Aplicar o agente siliconizing para 24h e enxague com água antes de usar.
  2. Execute o script TemperaturePhases (passo 4.3.3) e abrir o programa de gravação de vídeo (etapa 4.5).
  3. Explodir a mosca de um frasco de criação (etapa 2.2.2) para a Arena de voar (EG., 1 macho voar na Figura 3).
    1. Toma um frasco de moscas da incubadora, toque duas vezes para forçá-los a ir para o fundo, capturar uma mosca com um aspirador de boca e feche o frasco e colocá-lo de volta para a incubadora.
    2. Coloque a mosca na arena através da abertura que ficou entre a tampa de vidro e anel de alumínio (etapa 5.1.3).
    3. A lacuna entre a tampa de vidro e anel de alumínio, empurrando a tampa de vidro até atingir a borda do anel de alumínio como a mosca é introduzida para a Arena de voar.
  4. Coloque o quadro das luzes em torno da arena para garantir iluminação simétrica.
    1. Marca o local (ex., usando um marcador permanente) do quadro de luzes em torno da Arena voar (Figura 1) para garantir que o quadro é colocado sempre no mesmo local.
  5. Começar a gravar com o programa de gravação de vídeo (etapa 4.5.2) e pressione a barra de espaço do teclado do computador para começar a executar as fases experimentais (passo 4.3.4) controle.
  6. Fases experimentais afinal são feitas, salvar o vídeo em formato. MP4 ou. avi e remover a mosca da Arena de voar com o aspirador de boca.
    Nota: O fim das fases experimentais pode ser determinado por ambos os LEDs vermelhos indicativos, sendo desligados ou parando o script TemperaturePhases .
    1. Pare o gravação, pressionando o botão de parar no meio da parte inferior da tela no programa de gravação de vídeo. Pressione "arquivo | Salvar como"para salvar o vídeo.

6. vídeo monitoramento e análise de dados

  1. Use o FlySteps que segue o software (vídeo 2) para acompanhar os vídeos.
    1. Abra o "configuration_file.ini" dentro da pasta "FlyTracker".
    2. Defina a localização dos vídeos em "video_folder" e os nomes dos vídeos em "video_files".
    3. Especificar as bordas da Arena voar em "arena_settings", com base em (x, y) coordenadas de pixel de vários pontos na borda da arena.
    4. Especificar a localização dos LEDs vermelhas indicativas no "led_settings", com base em (x, y) coordenadas de pixel do local do centro dos LEDs.
    5. Verificar a localização das fronteiras da Arena voar, definindo "depurar" para "true" em "arena_settings", clicando em "Save" e executar o script no terminal. Uma captura de tela do vídeo vai aparecer com um quadrado azul, formado pelas coordenadas introduzidas em "arena_settings".
      Nota: Esta praça rodeia a área a ser rastreado.
    6. Alterar "depurar" em "arena_settings" para "false", clique em "Salvar" e executar a tela no terminal, mais uma vez.
      Nota: Isto irá iniciar o processo de rastreamento.
      Nota: Moscas podem sair da área de acompanhamento no anel de alumínio aquecido. Isso acontece durante os primeiros segundos de um experimento, após o qual moscas parem de tocar o anel aquecido e permanecem dentro da área de rastreamento.
      Nota: Os vídeos podem ser rastreados com outro software de rastreamento de acordo com as preferências do experimentador.
  2. Uso o (x, y) a localização de cada mosca fornecida pelo software de monitoramento para calcular a medida de interesse para o desempenho de temperatura. Scripts personalizados (ex., FlyStepsAnalysis em complementar) pode ser usado.
  3. Comparar as curvas de desempenho de temperatura de diferentes grupos de voar usando medições repetidas (RM), análise de variância (ANOVA) e post-hoc comparações múltiplas, usando o software estatístico (ver Tabela de materiais).

Resultados

A arena de temperatura controlada (figura 1A) é composto por três telhas de cobre, cuja temperatura pode ser controlada individualmente através de um circuito programável. Cada telha cobre possui um sensor de temperatura que dá feedback ao circuito programável. O circuito ativa uma fonte de alimentação para aumentar a temperatura de cada telha. Passivos elementos termoelétricos atuam como elementos de aquecimento constante para manter a temperatura d...

Discussão

Aqui nós apresentamos uma automatizado controlado por temperatura arena (Figura 1) que produz alterações de temperatura preciso no tempo e no espaço. Esse método permite que a exposição de individuais drosófila não só para pré-programados aumentos graduais de temperatura (Figura 2 e Figura 3), mas também aos desafios de temperatura dinâmica em que cada telha da arena voar era aquecida independentemente a uma te...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa de estudos da Behavioural e programa de neurociência cognitiva da Universidade de Groningen e uma bolsa de estudos de pós-graduação do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) do México, concedida a Andrea Soto-Padilla e uma doação da Fundação John Templeton, para o estudo de tempo atribuído a Hedderik van Rijn e Jean-Christophe Billeter. Nós também somos gratos a Peter Gerrit Bosma por sua participação no desenvolvimento do rastreador de FlySteps .

Scripts TemperaturePhases, FlySteps e FlyStepAnalysis podem ser encontrado como informação suplementar e no seguinte link temporário e publicamente disponível:
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Arduino DueArduinoA000062Software RUG
Electronics BoardRuijsink Dynamic EngineeringFF-Main-02-2014
Power supply BoostXP-Power 48. V 65 WECS65US48Set to 53 Volt
Power supply Tile HeatingXP-Power 15. V 80 WVFT80US15
Power supply CoolingXP-Power 15. V 130 WECS130U515
Peltier elementsMarlow IndustriesRC12-42 Elements, controlled DC feed
Heat sinkFisher TechnikLA 9/150-230VDecoupled for vibration
Temperature sensorsMeasurement SpecialtiesMCD_10K3MCD1Micro Thermistor Probe
Copper block/tilesRuijsink Dynamic EngineeringFF-CB-01-2014
Auminum ringRuijsink Dynamic EngineeringFF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mmRS Components111-2300 White conductive tape
Red LEDsLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daWavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED stripLedstripkoningHQ-3528-SMD60 LEDs per meter
Switch Power SupplyGenericT-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTime PlayerApple ComputerRecording program
Tracking analysis softwareRPackages: pacman
Tracking analysis softwareMATLAB
Thermal ImagingFLIR T400sc
Graphs and Statisticts SoftwareGraph Pad Prism
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100MLSiliconising agent
Fly rearing bottlesFlystuff32-1306oz Drosophila stock bottle
FlypadFlystuff59-114
Fly rearing vialsDominique Dutscher789008Drosophila tubes narrow 25x95 mm
IncubatorSanyoMIR-154
Magnetic hot plateHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ingredients B.V.010001.26.0
GlucoseGezond&wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SucroseVan GilseGranulated sugar
CornmealFlystuff62-100
Wheat germGezond&wel1017683
Soy flourFlystuff62-115
MolassesFlystuff62-117
Active dry yeastRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%

Referências

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