Un método automatizado para determinar el rendimiento de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura en el espacio y el tiempo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para determinar automáticamente el funcionamiento locomotor de Drosophila en cambios de temperatura con un campo de control de temperatura programable que produce cambios de temperatura rápida y precisa en tiempo y espacio.

Resumen

Temperatura es un factor ambiental omnipresente que afecta cómo especies se distribuyen y se comportan. Diferentes especies de moscas de la fruta Drosophila tienen respuestas concretas a los cambios de temperaturas en función de su tolerancia fisiológica y capacidad de adaptación. Moscas Drosophila también poseen una sistema que se ha convertido en fundamental para comprender la base neural de la temperatura de procesamiento en ectotermos de detección de temperatura. Presentamos aquí un campo de temperatura controlada que permite cambios de temperatura rápida y precisa con control temporal y espacial para explorar la respuesta de moscas individuales a cambios de temperatura. Individuales moscas se colocan en la arena y expuestas a temperatura pre programada de desafíos, tales como uniforme aumentos graduales de temperatura para determinar las normas de reacción o temperatura espacialmente distribuido al mismo tiempo para determinar preferencias. Individuos son rastreados automáticamente, permitiendo la cuantificación de la velocidad o ubicación de preferencia. Este método puede utilizarse para cuantificar rápidamente la respuesta sobre una amplia gama de temperaturas para determinar las curvas de rendimiento de la temperatura en Drosophila u otros insectos de tamaño similar. Además, puede utilizarse para estudios genéticos para cuantificar preferencias de temperatura y reacciones de mutantes o moscas de tipo salvaje. Este método puede ayudar a descubrir la base de la térmica especiación y adaptación, así como los mecanismos de los nervios detrás de proceso de temperatura.

Introducción

Temperatura es un factor ambiental constante que afecta a cómo funcionan y comportan¹organismos. Las diferencias en latitud y altitud conducen a diferencias en el tipo de organismo están expuestos, que resulta en la selección evolutiva de sus respuestas a^2,de temperatura³climas. Los organismos responden a diferentes temperaturas, a través de adaptaciones morfológicas, fisiológicas y conductuales que maximizan el rendimiento de sus entornos particulares⁴. Por ejemplo, en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, poblaciones de diferentes regiones tienen preferencias de temperatura diferentes, tamaños de cuerpo, tiempos de desarrollo, longevidad, fecundidad y rendimiento a pie a diferentes temperaturas^{2 ,5,6,7}. La diversidad observada entre moscas de diferentes orígenes se explica en parte por la variación genética y expresión de gene de plástico^8,9. Asimismo, especies de Drosophila de diferentes áreas distribuyen diferentemente entre gradientes de la temperatura y muestran diferencias en la resistencia al calor extremo y frío pruebas^10,11,12.

Drosophila se ha convertido recientemente en el modelo de elección para entender las bases genéticas y de los nerviosas de temperatura percepción^{13,14,15,16,17}. En términos generales, moscas adultas perciben temperatura mediante sensores de temperatura periférica frío y caliente en las antenas y sensores de temperatura en el cerebro^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. los receptores de la periferia para temperaturas expresan Gr28b.d¹⁶ o pirexia²¹, mientras que la periferia receptores fríos se caracterizan por Brivido¹⁴. En el cerebro, temperatura es procesada por neuronas expresan TrpA1¹⁵. Estudios de comportamiento en mutantes de estas vías están mejorando nuestra comprensión de cómo se procesa la temperatura y dan penetraciones en los mecanismos que varían entre las poblaciones de Drosophila de diferentes regiones.

Aquí describimos una arena con control de temperatura que produce cambios de temperatura rápida y precisa. Los investigadores pueden programar previamente estos cambios, que permite manipulaciones estandarizada y repetible de la temperatura sin intervención humana. Moscas se registran y se realiza un seguimiento con software especializado para determinar su posición y la velocidad en diferentes fases de un experimento. La principal medición presentada en este protocolo es la poca velocidad a diferentes temperaturas, ya que es un índice ecológico relevante de rendimiento fisiológico que puede identificar adaptabilidad térmica individual⁵. Junto con mutantes del receptor de temperatura, esta técnica puede ayudar a revelar los mecanismos de adaptación térmica a nivel celular y bioquímico.

Protocolo

1. preparación de alimentos mosca medio

1. Verter 1 L de agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L y añada una barra de agitación magnética. Poner el vaso en una placa magnética a 300 ° C hasta que se alcanza la temperatura de ebullición.
2. Revuelva a 500 rondas por minuto y agregue lo siguiente: 10 g de agar, 30 g de glucosa, 15 g de sacarosa, 15 g de harina de maíz, 10 g de germen de trigo, 10 g de harina de soja, 30 g de melaza y 35 g de active levadura seca.
3. Cuando la mezcla hace espuma vigorosamente, baje la temperatura de la placa caliente a 120 ° C manteniendo agitación.
4. Girar a la temperatura de la placa más hasta 30 ° C después de 10 min y continuar revolviendo hasta que la mezcla se haya enfriado a 48 ° C. Medir la temperatura introduciendo un termómetro directamente en la comida sin tocar las paredes del vaso.
5. Disolver 2 g de ésteres metílicos de ácidos p-hidroxi-benzoico en 10 mL de etanol al 96% y añadir a la mezcla, junto con 5 mL de ácido propiónico de 1 M. Seguir revolviendo durante 3 minutos.
6. Apague la placa caliente y vierta 45 mL de alimento en la cría botellas y 6,5 mL de alimentos en los frascos de colección.

2. preparación de las moscas

1. Lugar 20 varones y 20 mujeres vuela en las botellas de crianza que contiene 45 mL de medio de alimentos mosca. Transferir las moscas a las botellas de nuevo después de 3 a 4 días golpeando hacia abajo y luego aprovechando las botellas frescas. Deseche las moscas después de tres cambios.
   1. Colocar las botellas dentro de la incubadora bajo ciclos oscuros de 12 h luz/12 h con una temperatura constante de 25 ° C.
      Nota: Una nueva generación de moscas le eclose después de diez días.
2. Anestesiar nuevamente moscas eclosed de almohadillas de dióxido de carbono para un máximo de 4 minutos y recoger en mosca viales cría 2.5 x 9.5 cm con 6,5 mL de medio de alimentos mosca con un pincel.
   1. Recoger sólo Virgen moscas y separarlos por sexo en grupos de 20 moscas por frasco de cría.
   2. Colocar los frascos dentro de incubadoras durante 5-7 días, cambiando las moscas a viales nuevos cada 2-3 días y en los días antes de los experimentos.

3. marco de luces

1. Hacer un marco de madera de 10 cm de longitud, 4 cm de ancho, altura 4 cm y 0,5 cm de espesor.
2. En cada uno de los bordes cortos, crear un borde de 4 cm de longitud, 4 cm de altura y 1,5 cm de ancho hacia el interior área de la estructura de madera. Deja la cara interna de la frontera abierta.
3. Taladre dos orificios de 0,5 cm de diámetro en la intersección de uno de los bordes laterales de la estructura de madera y en cada una de las fronteras en los bordes cortos.
4. Lugar de 10 cm de una tira de LED blanco cálida dentro de cada una de las fronteras en los bordes cortos. Pele la parte posterior de la tira de LED para encolarla inmediatamente.
   Nota: Para los experimentos en que la iluminación se debe eliminar, puede sustituirse la tira de LED blanco cálida LED infrarrojo tiras.
5. Conecte un extremo de la tira de LED en una de las fronteras a la fuente de alimentación conmutada y su otro extremo a la tira de LED en el borde opuesto.
6. Encienda la fuente de alimentación conmutada para verificar que ambas tiras de LED se encienda.
7. Cubra el lado abierto de cada borde con un trozo blanco de papel.
8. Pegar otro trozo de papel a cada una de las fases internas de los bordes laterales.

4. control de temperatura de la Arena

1. Encienda la arena con control de temperatura (figura 1A y 1C). Asegúrese de que el ventilador comienza a funcionar y el anillo de aluminio comienza a calentar.
2. Utilice un cable USB para conectar la arena con control de temperatura para la computadora de control, ejecutar el script TemperaturePhases con las secuencias de la temperatura.
3. Abrir el script TemperaturePhases en la computadora de control y verificar que la secuencia de temperatura está configurada correctamente (Video 1).
   1. Comprobar que la duración de cada fase experimental se establece en 60 s verificando que "par. StimulusDur"es igual a 60 s.
   2. Compruebe que el número 1) igual al número de fases, 2) iterativas ON/OFF ajuste de la luz roja indica diodos (LEDs), aumento de la temperatura del ° C 3) 2 por fase, deseado y 4) 16 ° C como temperatura inicial todo correcto debajo de "Inicio de la experimental sección del bloque".
      Nota: Deje que las moscas se adapte a la Arena vuela por 7 min a 16 ° C para evitar un aumento artificial de la velocidad durante las primeras fases experimentales (figura 2).
   3. Ejecute el script TemperaturePhases . El software se inicializa durante 5 segundos como en "arena. Wait"y luego stop.
   4. Presione la barra espaciadora del teclado para empezar a correr las fases experimentales una vez que una mosca se ha fundido en la Arena de la mosca (paso 5.3).
      Nota: El TemperaturePhases es el script actual control de la caja; sin embargo, es posible crear otros scripts personalizados para utilizar este dispositivo que se ajustan a los requisitos de diferentes experimentos.
4. Conecte la cámara encima de la arena para el equipo de grabación usando el cable USB de la cámara.
5. Abrir el programa de grabación de vídeo (véase Tabla de materiales) en el equipo de grabación seleccionando "archivo | Nueva grabación de película". Se abrirá una pantalla que muestra la imagen de la cámara.
   1. Asegúrese de que la imagen de la cámara capta todos los bordes de la arena y el LED rojo indicativo.
   2. Iniciar la grabación pulsando el botón rojo en medio del borde inferior de la pantalla que muestra la imagen una vez que el cuadro de luces se encuentra alrededor de la arena (paso 5.4).
      Nota: pequeños cambios en la iluminación puede afectar la precisión de seguimiento. Se recomienda para mantener la iluminación del recinto de control de temperatura constante mediante la fijación de la ubicación del aparato.

5. temperatura experimentos conductuales

1. Preparar la Arena mosca (figura 1).
   1. Colocar un filamento de cinta conductora blanca en la parte superior de las baldosas de cobre, asegurando que cubrir todos los bordes.
   2. Coloque el anillo de aluminio calentado alrededor de las baldosas de cobre. El borde del anillo encaja perfectamente en las baldosas de cobre por lo que siempre se coloca en el mismo lugar.
   3. Limpie la cubierta de vidrio con un paño limpio y colóquelo en la parte superior del anillo de aluminio, dejando un espacio a través del cual puede soplarse en una mosca.
      Nota: Antes de los experimentos, capa de la cubierta de vidrio con el agente siliconado para crear una superficie resbalosa. Aplique al agente siliconado para 24 horas y enjuagar con agua antes de usarla.
2. Ejecute el script TemperaturePhases (paso 4.3.3) y abrir el programa de grabación de vídeo (paso 4.5).
3. Volar la mosca de un frasco de cultivo (paso 2.2.2) en la mosca de Arena (por ej., 1 hombre volar en la figura 3).
   1. Tomar un frasco de las moscas de la incubadora, púlselo dos veces para obligarlos a ir a la parte inferior, atrapar una mosca con un aspirador de boca y cerrar el frasco y lo pones de nuevo en la incubadora.
   2. Colocar la mosca en la arena el espacio que ha quedado entre la tapa de cristal y anillo de aluminio (paso 5.1.3).
   3. Cerrar la brecha entre la cubierta de cristal y anillo de aluminio empujando la tapa de vidrio hasta que alcance el borde del anillo de aluminio como la mosca se introduce a la mosca de Arena.
4. Coloque el marco de luces alrededor de la arena para iluminación simétrica.
   1. Marque la ubicación (por ej., usando un marcador permanente) del cuadro de luces alrededor de la Arena de volar (figura 1) para asegurar que el marco se coloca siempre en el mismo lugar.
5. Iniciar la grabación con el programa de grabación de vídeo (paso 4.5.2) y presione la barra espaciadora en el teclado de la computadora de control para comenzar a correr las fases experimentales (paso 4.3.4).
6. Fases experimentales después de todo se hacen, guardar el video en formato. MP4 o .avi y eliminar la mosca de la Arena vuela con el aspirador de boca.
   Nota: Al final de las fases experimentales se puede determinar por ambos LED rojo indicativo sea apagado o por la detención de secuencia de comandos TemperaturePhases .
   1. Detener el grabación presionando el botón de parada en medio del borde inferior de la pantalla en el programa de grabación de vídeo. Presione "archivo | Guardar como"para guardar el video.

6. vídeo de seguimiento y análisis de datos

1. Utilizar FlySteps (Video 2) el software de seguimiento para los videos.
   1. Abrir el "configuration_file.ini" dentro de la carpeta "FlyTracker".
   2. Establecer la ubicación de los vídeos de "video_folder" y los nombres de los vídeos de "video_files".
   3. Especificar las fronteras de la Arena vuela en "arena_settings" basado en (x, y) coordenadas de píxeles de varios puntos en el borde de la arena.
   4. Especificar la ubicación de los LED rojo indicativos en "led_settings" basado en (x, y) coordenadas de píxel de la ubicación del centro de los LEDs.
   5. Compruebe la ubicación de las fronteras de la mosca de Arena mediante el establecimiento de "debug" a "true" en "arena_settings", clic en "Guardar" y ejecutar el script en la terminal. Una captura de pantalla del video aparece con un cuadrado azul formado por las coordenadas introducidas en "arena_settings".
      Nota: Esta plaza rodea la zona para realizar un seguimiento.
   6. Cambiar "debug" en "arena_settings" a "false", haga clic en "Guardar" y ejecutar la pantalla en el terminal una vez más.
      Nota: Con esto iniciará el proceso de seguimiento.
      Nota: Moscas pueden caminar fuera del área de seguimiento a la anilla de aluminio caliente. Esto ocurre durante los primeros segundos de un experimento, después de lo cual moscas dejará de tocar el anillo caliente y permanecen dentro del área de seguimiento.
      Nota: Los Videos pueden ser rastreados con otro software de seguimiento de acuerdo a las preferencias del experimentador.
2. Uso (x, y) la ubicación de cada mosca que proporciona el software de seguimiento para calcular la medida de interés para el funcionamiento de la temperatura. Scripts personalizados (e.g., FlyStepsAnalysis en complementario) puede ser utilizado.
3. Comparar las curvas de rendimiento de la temperatura de los diferentes grupos de moscas utilizando análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas (MR) y post-hoc de comparaciones múltiples utilizando el software estadístico (véase Tabla de materiales).

Resultados

El ámbito de control de temperatura (figura 1A) se compone de tres naipes de cobre cuya temperatura puede ser controlada individualmente a través de un circuito programable. Cada azulejo de cobre posee un sensor de temperatura que da retroalimentación al circuito programable. El circuito activa una fuente de alimentación para aumentar la temperatura de cada azulejo. Elementos termoeléctricos pasivos actúan como elementos de calefacción constante para m...

Discusión

Aquí hemos presentado una automatizado con control de temperatura arena (figura 1) que produce cambios de la temperatura exacto en tiempo y espacio. Este método permite la exposición del individuo de la Drosophila no sólo pre-programados aumenta gradual de la temperatura (figura 2 y figura 3), sino a los retos de la temperatura dinámica en el cual se calentó cada baldosa de la arena mosca forma independiente a una tem...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Due	Arduino	A000062	Software RUG
Electronics Board	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-Main-02-2014
Power supply Boost	XP-Power 48. V 65 W	ECS65US48	Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating	XP-Power 15. V 80 W	VFT80US15
Power supply Cooling	XP-Power 15. V 130 W	ECS130U515
Peltier elements	Marlow Industries	RC12-4	2 Elements, controlled DC feed
Heat sink	Fisher Technik	LA 9/150-230V	Decoupled for vibration
Temperature sensors	Measurement Specialties	MCD_10K3MCD1	Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-CB-01-2014
Auminum ring	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm	RS Components	111-2300	White conductive tape
Red LEDs	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip	Ledstripkoning	HQ-3528-SMD	60 LEDs per meter
Switch Power Supply	Generic	T-36-12
Logitech c920	Logitech Europe S.A	PN960-001055
QuickTime Player	Apple Computer		Recording program
Tracking analysis software	R		Packages: pacman
Tracking analysis software	MATLAB
Thermal Imaging	FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software	Graph Pad Prism
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML	Siliconising agent
Fly rearing bottles	Flystuff	32-130	6oz Drosophila stock bottle
Flypad	Flystuff	59-114
Fly rearing vials	Dominique Dutscher	789008	Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator	Sanyo	MIR-154
Magnetic hot plate	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic Ingredients B.V.	010001.26.0
Glucose	Gezond&wel	1019155	Dextrose/Druivensuiker
Sucrose	Van Gilse		Granulated sugar
Cornmeal	Flystuff	62-100
Wheat germ	Gezond&wel	1017683
Soy flour	Flystuff	62-115
Molasses	Flystuff	62-117
Active dry yeast	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%