שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן אוטומטי את ביצועי גינקולוגיות דרוזופילה -שינוי הטמפרטורות באמצעות לתכנות מבוקרי טמפרטורה ארנה שמייצר שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים בזמן ובמרחב.

Abstract

הטמפרטורה היא גורם סביבתי בכל מקום זה משפיע על איך מינים להפיץ ולהתנהג. מינים שונים של זבובי דרוזופילה פירות יש תגובות ספציפיות לשינוי הטמפרטורות בהתאם הסתגלות סובלנות הפיזיולוגית שלהם. זבובים דרוזופילה בעלי גם חום חישה מערכת הפך בסיסי להבנת הבסיס העצבי של טמפרטורת עיבוד ב- ectotherms. אנו מציגים כאן ארנה מבוקרי טמפרטורה המאפשרת שינויי טמפרטורה מדויקת ומהירה עם שליטה הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי כדי לחקור את התגובה של זבובים בודדים את שינוי הטמפרטורה. זבובים בודדים להציב בזירה, נחשפים אתגרים טמפרטורה מתוכנתים מראש, כגון הדרגתי אחיד מגביר טמפרטורה כדי לקבוע נורמות התגובה או טמפרטורות המפוזרים במרחב בו זמנית כדי לקבוע העדפות. אנשים מתבצע באופן אוטומטי, המאפשר כימות של העדפה מהירות או מיקום. בשיטה זו ניתן לכמת במהירות התגובה על מגוון רחב של טמפרטורות כדי לקבוע טמפרטורה ביצועים עקומות דרוזופילה או חרקים אחרים באותו סדר גודל. בנוסף, זה יכול לשמש עבור מחקרים גנטיים לכמת טמפרטורה העדפות ותגובות של מוטציות או פראי-סוג זבובים. שיטה זו יכולה לעזור לחשוף את הבסיס של היווצרות המינים תרמי, הסתגלות, כמו גם המנגנונים העצביים העומדים מאחורי בטמפרטורה.

Introduction

טמפרטורה היא גורם סביבתי מתמיד זה משפיע על איך אורגניזמים לפעול ולהתנהג¹. הבדלי גובה ורוחב להוביל הבדלים בסוג באקלים האורגניזם נחשפים, שתוצאתה בחירה אבולוציונית לתגובתם טמפרטורה^2,3. האורגניזמים להגיב טמפרטורות שונות דרך עיבודים מורפולוגי, פיזיולוגיים והתנהגותיים זה למקסם ביצועים תחת שלהם מסוים סביבות⁴. לדוגמה, זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, אוכלוסיות מאזורים שונים יש העדפות טמפרטורה שונות, הגוף גדלים, פעמים התפתחותית, אריכות-חיים, פוריות וביצועים הליכה בטמפרטורות שונות^{2 ,5,6,7}. המגוון שנצפה בין הזבובים ממוצא שונה מוסבר בחלקו על ידי וריאציה גנטית גן פלסטיק הביטוי^8,9. באופן דומה, מינים דרוזופילה מאזורים שונים להפיץ באופן שונה בין מעברי צבע טמפרטורה ולהראות הבדלים ההתנגדות החום הקיצוני, בדיקות קר^10,11,12.

דרוזופילה הפך גם לאחרונה מודל הבחירה כדי להבין את הבסיס הגנטי והעצבים של טמפרטורה תפיסה^{13,14,15,16,17}. באופן כללי, הזבוב הבוגר תופסים טמפרטורה באמצעות חיישני טמפרטורה היקפיים קרים וחמים, מחושיהם ודרך חיישני טמפרטורה^{15,16 14,13,}המוח ^{, 17 , 18 , 19 , 20}. קולטני הפריפריה לטמפרטורות חם אקספרס Gr28b.d¹⁶ או Pyrexia²¹, תוך הפריפריה מאופיינים קולטנים קר Brivido¹⁴. במוח, טמפרטורה מעובד על ידי נוירונים לבטא TrpA1¹⁵. מחקרים התנהגותיים על מוטציות של המסלולים הללו משתפרים הבנתנו כיצד מעובד בטמפרטורה ולתת תובנות מנגנונים משתנים בין אוכלוסיות של דרוזופילה ממחוזות שונים.

כאן נתאר ארנה מבוקרי טמפרטורה שמייצר שינויי טמפרטורה מדויקת ומהירה. חוקרים יכולים מראש תכנית שינויים אלה, אשר מאפשר מניפולציות טמפרטורה סטנדרטית ו הדיר ללא התערבות אנושית. זבובים הם הקליטו, במעקב עם תוכנות מיוחדות כדי לקבוע את המיקום שלהם ואת המהירות בכל השלבים השונים של ניסוי. המדד העיקרי הוצג פרוטוקול זה הוא מהירות הליכה בטמפרטורות שונות, כי הוא אינדקס רלוונטי מבחינה אקולוגית בביצועים פיזיולוגיים ניתן לזהות הסתגלות תרמיות בודדות⁵. יחד עם טמפרטורה קולטן מוטציות, טכניקה זו יכולה לסייע לחשוף את המנגנונים של עיבוד תרמי ברמה התאית וביוכימי.

Protocol

1. הכנת אוכל לטוס בינוני

1. שופכים 1 ליטר של מי ברז לתוך גביע זכוכית 2 ל', להוסיף פס מגנטי מערבבים. לשים את הספל על פלטה מגנטית ב 300 ° C עד רותחים בטמפרטורה.
2. מערבבים-כדורים לדקה 500 ולהוסיף את הפעולות הבאות: 10 גרם של אגר 30 גר' גלוקוז, 15 גר' סוכרוז, 15 גר' קמח תירס, 10 גרם של נבט חיטה, 10 גרם קמח סויה, 30 גר' מולסה, 35 גרם שמרים יבשים פעילים.
3. כאשר מערבבים קצף נמרצות, להנמיך את הטמפרטורה פלטה עד 120 ° C תוך כדי ערבוב.
4. להפעיל את הטמפרטורה פלטה נוספת עד 30 מעלות צלזיוס לאחר 10 דקות ולהמשיך לערבב עד המיקס מתקררת כדי 48 º C. למדוד את הטמפרטורה על-ידי הוספת מד חום ישירות לתוך האוכל בלי לגעת בקירות של הספל.
5. לפזר 2 גר' p-הידרוקסי-בנזואית חומצה מתיל אסטר לתוך 10 מ"ל אתנול 96%, להוסיף את התערובת יחד עם 5 מ ל חומצה propionic 1 מ'. המשך ערבוב למשך 3 דקות.
6. כבה את הכיריים ויוצקים 45 מ ל מזון לתוך בקבוקים rearing ו 6.5 מ ל מזון לתוך הבקבוקונים אוסף.

2. הכנת זבובים

1. מקום 20 גברים ו- 20 נקבה זבובים לבקבוקים rearing המכיל 45 מ של אוכל לטוס בינוני. העברת הזבובים בקבוקים חדשים לאחר 3-4 ימים על-ידי הקשה אותם למטה ולאחר מכן הקשה על אותם לתוך הבקבוקים טריים. למחוק את הזבובים לאחר שלושה שינויים.
   1. מקם את הבקבוקים בתוך החממה תחת 12-h אור/12-h מחזורים כהה עם טמפרטורת חום קבועה של 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: דור חדש של זבובים יהיה eclose לאחר עשרה ימים.
2. עזים ומתנגד לאחרונה eclosed זבובים על רפידות פחמן דו-חמצני לכל היותר 4 דקות ולאסוף אותם 2.5 x 9.5 ס מ לטוס לגידול צלוחיות עם 6.5 מ של מדיום מזון לעוף באמצעות מברשת.
   1. לאסוף זבובים בתולה רק ולהפריד ביניהם על ידי קבוצות של זבובים 20 לכל גידול המבחנה.
   2. מקם את הבקבוקונים בתוך אינקובטורים במשך 5-7 ימים, שינוי הזבובים בקבוקונים חדשים כל 2-3 ימים, בימים לפני הניסויים.

3. מסגרת של אורות

1. ליצור מסגרת עץ של 10 ס מ אורך, רוחב 4 ס"מ, 4 ס מ גובה 0.5 ס מ עבה.
2. על כל אחד הקצוות קצר, ליצור גבול של 4 ס מ אורך 4 ס מ גובה, רוחב 1.5 ס מ לכיוון הבתוך שטח של מסגרת העץ. השאר הפנים הפנימי של הגבול פתוח.
3. תרגיל שני חורים של 0.5 ס מ קוטר בנקודת החיתוך של אחד הקצוות ארוך של מסגרת העץ ועל כל הגבולות בקצוות קצר.
4. מקום 10 ס מ של רצועה LED לבנה חמה בתוך כל אחד הגבולות על הקצוות קצר. לקלף האחורי של רצועת LED להדביק אותו מיד במקום.
   הערה: עבור ניסויים ב שעליה תאורה צריכים להיות מסולקים, רצועת LED לבן חם הרבה מכדי LED אינפרא-אדום רצועות.
5. להתחבר קצה אחד של רצועת LED באחד הגבולות את אספקת החשמל מיתוג, סופו אחרים לרצועת LED על הגבול ההפוך.
6. הפעל את אספקת החשמל מיתוג כדי לוודא כי שתי רצועות LED להפעיל.
7. לכסות את הצד הפתוח של כל גבול עם פיסת נייר לבן.
8. דבק עוד פיסת נייר על כל אחד מהשלבים פנימי של קצוות ארוכים.

4. טמפרטורה מבוקרת ארנה

1. הפעל את הזירה מבוקרי טמפרטורה (איור 1A וג 1). ודא המאוורר מתחיל לרוץ הטבעת אלומיניום מתחיל מתחמם.
2. להשתמש בכבל USB להתחבר הזירה טמפרטורה מבוקרת מחשב בקרת להריץ את הסקריפט TemperaturePhases עם הרצפים טמפרטורה.
3. פתח את התסריט TemperaturePhases שליטה במחשב וודא כי הרצף טמפרטורה מוגדרת כראוי (Video 1).
   1. בדוק כי משך הזמן של כל שלב נסיוני מוגדר כ- 60 s על-ידי אימות "הגומה. StimulusDur"שווה ל- 60 s.
   2. בדוק כי 1) המספר השווה רצוי מספר שלבים, 2) איטרטיבי ON/OFF ההקמה של מעיד על אדום דיודות מפיצות אור (נוריות), 3) 2 ° C בטמפרטורה לכל שלב, 4) 16 ° C כמו הטמפרטורה המוצא שכולכם צודקים תחת "התחל את ניסיוני מדור "אבן.
      הערה: לאפשר את הזבובים להסתגלות לזירה לטוס במשך 7 דקות ב 16 ° C כדי למנוע גידול מלאכותיים של מהירות במהלך שלבי הניסוי הראשון (איור 2).
   3. להריץ את הסקריפט TemperaturePhases . התוכנה לאתחל במשך 5 שניות כפי שנקבע "בזירה. המתן", אז תפסיק.
   4. הקש על מקש הרווח של לוח המקשים כדי להתחיל הפעלת את שלבי הניסוי פעם זבוב פוצץ אל תוך הזירה לעוף (שלב 5.3).
      הערה: TemperaturePhases הוא script הנוכחי שליטה התיבה; עם זאת, ניתן ליצור סקריפטים מותאמים אישית אחרים לשימוש בהתקן זה להתאים לדרישות של ניסויים שונים.
4. חבר את המצלמה על הזירה הקלטה למחשב באמצעות כבל ה-USB של המצלמה.
5. פתח את התוכנית הקלטת וידאו (ראה טבלה של חומרים) הקלטה במחשב על-ידי בחירה "קובץ | סרט ההקלטה החדשה". המסך מציג את התמונה מן המצלמה תיפתח.
   1. ודא כי תמונת המצלמה לוכדת כל הקצוות של הזירה, מעיד על נוריות אדומות.
   2. . תתחיל להקליט על ידי לחיצה על הכפתור האדום באמצע הקצה התחתון של המסך מציג את תמונת המצלמה ברגע המסגרת של אורות הוגדרה סביב הזירה (שלב 5.4)
      הערה: שינויים קטנים בתחום התאורה יכולים להשפיע הדיוק של המעקב. מומלץ לשמור את ההארה של הזירה מבוקרי טמפרטורה קבועה על ידי תיקון המיקום של המנגנון.

5. הטמפרטורה ניסויים התנהגותיים

1. להכין את הזירה לעוף (איור 1C).
   1. במקום חוט לבן דבק מוליך על האריחים נחושת, הבטחת שכל הקצוות מכוסים.
   2. מניחים את הטבעת אלומיניום המחוממת סביב האריחים נחושת. הקצה של הטבעת מתאים באופן מושלם סביב האריחים נחושת אז מניחים אותה תמיד באותו מיקום.
   3. לנקות את מכסה זכוכית עם טישו נקייה ומניחים אותו על הטבעת אלומיניום, השארת רווח שדרכו זבוב יכול להיות מפוצץ ב.
      הערה: לפני הניסויים, מעיל מכסה זכוכית עם הסוכן siliconizing כדי ליצור משטח חלקלק. החל הסוכן siliconizing במשך 24 שעות ביממה, לשטוף אותו עם מים לפני השימוש.
2. להריץ את הסקריפט TemperaturePhases (שלב 4.3.3) ופתח את התוכנית הקלטת וידאו (שלב 4.5).
3. לפוצץ את הזבוב מ בקבוקון rearing (שלב 2.2.2) אל תוך הזירה לעוף (למשל., 1 זכר לטוס באיור3).
   1. לקחת בקבוקון של זבובים מן החממה, לחץ עליה פעמיים כדי לכפות עליהם ללכת למטה, השמנה של זבוב אחד עם העצמות הפה, לסגור את הצנצנת ואת סינרול החממה.
   2. מקם את הזבוב בזירה דרך הפרצה שננטש בין מכסה זכוכית טבעת אלומיניום (שלב 5.1.3).
   3. לסגור את הפער בין מכסה זכוכית אלומיניום טבעת על ידי דוחף את מכסה הזכוכית עד שהוא מגיע לקצה של הטבעת אלומיניום ברגע הזבוב הוא הציג לזירה לעוף.
4. להציב את המסגרת של אורות סביב הזירה כדי להבטיח תאורה סימטרי.
   1. סמן את המיקום (למשל., שימוש בסמן קבוע) של המסגרת של אורות סביב לטוס הזירה (איור 1C) כדי להבטיח כי המסגרת ממוקמת תמיד באותו מיקום.
5. להתחיל להקליט עם התוכנית הקלטת וידאו (שלב 4.5.2), הקש על מקש הרווח במקלדת של המחשב הבקרה כדי להתחיל הפעלת את שלבי הניסוי (שלב 4.3.4).
6. ניסיוני אחרי כל השלבים נעשים, שמירת הוידאו בתבנית .mp4 או .avi ולהסיר הזבוב מן הזירה לטוס עם העצמות הפה.
   הערה: בסוף שלבי הניסוי יכול להיקבע על ידי שתי נוריות אדומות מעיד על להיות כבויים או ההפסקה script TemperaturePhases .
   1. לעצור את הקלטת על ידי לחיצה על הלחצן ' עצור ' באמצע הקצה התחתון של המסך בתוכנית הקלטת הוידאו. הקש "קובץ | "שמור בשם כדי לשמור את הווידאו.

6. וידאו מעקב וניתוח נתונים

1. השתמש FlySteps (סרטון 2) תוכנת מעקב כדי לבצע מעקב אחר קטעי וידאו.
   1. פתח את "configuration_file.ini" בתוך התיקיה "FlyTracker".
   2. הגדר את המיקום של קטעי וידאו ב- "video_folder" ואת שמותיהם של קטעי וידאו ב- "video_files".
   3. לציין גבולות הזירה לטוס ב- "arena_settings" על בסיס (x, y) קואורדינטות של נקודות מרובות בקצה הזירה.
   4. ציין את המיקום של נוריות אדומות מעיד ב- "led_settings" על בסיס (x, y) קואורדינטות פיקסלים של המיקום של המרכז של הנוריות.
   5. בדוק את מיקומו של גבולות הזירה לעוף על-ידי הגדרת "באגים" 'נכונה' ב- "arena_settings", לחיצה על "שמור", להריץ את הסקריפט בתוך הטרמינל. לכידת מסך של הוידאו יופיע עם ריבוע כחול הנוצרת על-ידי הקואורדינטות שהוזנו ב- "arena_settings".
      הערה: כיכר זו מקיפה את האזור לבצע אחריהם מעקב.
   6. לשנות "באגים" ב- "arena_settings" ל- "false", לחץ על "שמור", ולהפעיל את המסך בטרמינל עוד פעם.
      הערה: אפשרות זו תפעיל את תהליך מעקב.
      הערה: זבובים יכולים ללכת אל מחוץ לאזור מעקב על גבי הטבעת אלומיניום מחוממת. זה קורה במהלך השניות הראשונות של ניסוי, אחרי אשר זבובים. תפסיק לגעת את הטבעת מחוממת ולהישאר בתוך האזור מעקב.
      הערה: ניתן לעקוב קטעי וידאו עם אחרים תוכנת מעקב לפי ההעדפות של הנסיין.
2. שימוש (x, y) המיקום של כל זבוב שסופקו על-ידי תוכנת מעקב כדי לחשב את מידת הריבית עבור הביצועים בטמפרטורה. קבצי script מותאמים אישית (למשל., FlyStepsAnalysis ב Supplementary) יכול לשמש.
3. להשוות את עקומות הביצועים בטמפרטורה של קבוצות שונות לעוף באמצעות מדידות חוזרות ונשנות (RM) השונות (ANOVA) ופוסט-הוק השוואות מרובות באמצעות תוכנה סטטיסטית (ראה טבלה של חומרים).

תוצאות

הזירה מבוקרי טמפרטורה (איור 1 א') מורכב שלוש אבנים נחושת שהטמפרטורה שלהם יכול להיות נשלט בנפרד במעגל לתכנות. כל אריח נחושת בעל חיישן טמפרטורה שנותן משוב המעגל לתכנות. המעגל הפעלת ספק כוח כדי להגדיל את הטמפרטורה של כל אריח. אלמנטים פסיביים תרמואלקטרי לשמש ה?...

Discussion

כאן הובאו אוטומטיים מבוקרי טמפרטורה זירה (איור 1) שמייצר שינויי טמפרטורה מדויקת בזמן ובמרחב. שיטה זו מאפשרת חשיפה של הפרט דרוזופילה מחיישנים מגביר הדרגתית של הטמפרטורה (איור 2 , איור 3) אלא גם לאתגרים טמפרטורה דינמי שבו כל אריח של הזירה ז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Due	Arduino	A000062	Software RUG
Electronics Board	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-Main-02-2014
Power supply Boost	XP-Power 48. V 65 W	ECS65US48	Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating	XP-Power 15. V 80 W	VFT80US15
Power supply Cooling	XP-Power 15. V 130 W	ECS130U515
Peltier elements	Marlow Industries	RC12-4	2 Elements, controlled DC feed
Heat sink	Fisher Technik	LA 9/150-230V	Decoupled for vibration
Temperature sensors	Measurement Specialties	MCD_10K3MCD1	Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-CB-01-2014
Auminum ring	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm	RS Components	111-2300	White conductive tape
Red LEDs	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip	Ledstripkoning	HQ-3528-SMD	60 LEDs per meter
Switch Power Supply	Generic	T-36-12
Logitech c920	Logitech Europe S.A	PN960-001055
QuickTime Player	Apple Computer		Recording program
Tracking analysis software	R		Packages: pacman
Tracking analysis software	MATLAB
Thermal Imaging	FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software	Graph Pad Prism
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML	Siliconising agent
Fly rearing bottles	Flystuff	32-130	6oz Drosophila stock bottle
Flypad	Flystuff	59-114
Fly rearing vials	Dominique Dutscher	789008	Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator	Sanyo	MIR-154
Magnetic hot plate	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic Ingredients B.V.	010001.26.0
Glucose	Gezond&wel	1019155	Dextrose/Druivensuiker
Sucrose	Van Gilse		Granulated sugar
Cornmeal	Flystuff	62-100
Wheat germ	Gezond&wel	1017683
Soy flour	Flystuff	62-115
Molasses	Flystuff	62-117
Active dry yeast	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%