Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell'apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.

Abstract

Temperatura è un fattore ambientale onnipresente che colpisce come specie distribuire e comportarsi. Diverse specie di mosche della frutta Drosophila hanno risposte specifiche alla variazione della temperatura secondo la loro tolleranza fisiologica e adattabilità. Drosofila mosche possiedono anche un sistema che è diventata fondamentale per comprendere le basi neurali della temperatura di lavorazione in ectotermi di rilevamento della temperatura. Presentiamo qui una arena temperatura controllata che consente cambi di temperatura veloce e preciso controllo temporale e spaziale per studiare la risposta di singoli mosche a temperature variabili. Mosche individuali sono collocati nell'arena ed esposti alle sfide di temperatura pre-programmati, come uniforme graduale aumenta di temperatura per determinare norme di reazione o temperature spazialmente distribuite allo stesso tempo di determinare le preferenze. Gli individui vengono monitorati automaticamente, consentendo la quantificazione della velocità o posizione di preferenza. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare rapidamente la risposta sopra un ampio range di temperature per determinare le curve di prestazione di temperatura in Drosophila o altri insetti di dimensioni simili. Inoltre, può essere utilizzato per studi genetici di quantificare le preferenze di temperatura e reazioni di mutanti o selvaggio-tipo mosche. Questo metodo può aiutare a scoprire la base della speciazione termica e adattamento, come pure i meccanismi neurali dietro lavorazione temperatura.

Introduzione

Temperatura è un fattore ambientale costante che colpisce come organismi funzionano e comportano¹. Le differenze in latitudine e altitudine portano a differenze nel tipo di climi organismo sono esposti, che si traduce in selezione evolutiva per le loro risposte a temperatura^2,3. Gli organismi rispondono a diverse temperature attraverso adattamenti morfologici, fisiologici e comportamentali che massimizzano le prestazioni sotto loro particolari ambienti⁴. Per esempio, nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster, popolazioni provenienti da diverse regioni hanno preferenze diverse temperatura, dimensioni del corpo, volte inerente allo sviluppo, longevità, fecondità e prestazioni a piedi a diverse temperature^{2 ,5,6,7}. La diversità osservata tra mosche di diverse provenienze si spiega in parte con variazione genetica ed espressione genica plastica^8,9. Allo stesso modo, specie di Drosophila provenienti da diverse aree distribuire in modo diverso tra i gradienti di temperatura e mostrare le differenze nella resistenza a calore estremo e freddo test^10,11,12.

Drosophila anche recentemente è diventato il modello di scelta per comprendere le basi genetiche e neurali della temperatura percezione^{13,14,15,16,17}. In generale, mosche adulte percepiscono temperatura mediante sensori di temperatura periferica caldi e freddi nelle antenne e sensori di temperatura nel cervello^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. i recettori di periferia per alte temperature express Gr28b.d¹⁶ o piressia²¹, mentre la periferia freddi recettori sono caratterizzati da Brivido¹⁴. Nel cervello, la temperatura viene elaborato dai neuroni che esprimono TrpA1¹⁵. Studi comportamentali su mutanti di queste vie sono migliorare la nostra comprensione di come la temperatura viene elaborato e dare spunti nei meccanismi che variano fra le popolazioni di Drosophila da diverse regioni.

Qui descriviamo una arena temperatura controllata che produce i cambiamenti di temperatura veloce e preciso. Gli investigatori possono pre-programmare questi cambiamenti, che consente per le manipolazioni di temperatura standardizzata e ripetibile senza intervento umano. Mosche sono registrati e monitorati con software specializzato per determinarne la posizione e la velocità nelle diverse fasi di un esperimento. La misura principale presentata in questo protocollo è la velocità di camminata a diverse temperature, perché è un indice ecologicamente rilevante di prestazione fisiologica che possa identificare adattabilità individuale termico⁵. Insieme a mutanti del recettore di temperatura, questa tecnica può aiutare a rivelare i meccanismi di adattamento termico a livello cellulare e biochimico.

Protocollo

1. preparazione di alimento Medium

1. Versare 1 L di acqua di rubinetto in un bicchiere di vetro 2L e aggiungere un ancoretta magnetica. Mettere il bicchiere su un piatto caldo magnetico a 300 ° C fino a quando non viene raggiunta la temperatura di ebollizione.
2. Mescolare a 500 giri/min e aggiungere il seguente: 10 g di agar, 30 g di glucosio, 15 g di saccarosio, 15 g di farina di mais, 10 g di germe di grano, 10 g di farina di soia, 30 g di melassa e 35 g di attivo lievito secco.
3. Quando il mix schiume vigorosamente, abbassare la temperatura della piastra calda a 120 ° C continuando a mescolare.
4. Girare la piastra calda temperatura ulteriormente fino a 30 ° C dopo 10 min e continuare a mescolare fino a quando la miscela si raffredda a 48 ° C. Misurare la temperatura inserendo un termometro direttamente il cibo senza toccare le pareti del bicchiere.
5. Sciogliere 2 g di estere metilico dell'acido p-idrossi-benzoico in 10 mL di etanolo al 96% e aggiungerlo al mix, insieme a 5 mL di acido propionico 1m. Continuare a mescolare per 3 min.
6. Spegnere la piastra calda e versare 45 mL di cibo nel allevamento bottiglie e 6,5 mL di cibo nei flaconi di raccolta.

2. preparazione di mosche

1. Posto 20 maschi e 20 femmine vola nelle bottiglie allevamento contenente 45 mL di mezzo di volare. Trasferire le mosche a nuove bottiglie dopo 3 o 4 giorni toccando loro giù e poi li nelle bottiglie fresche. Scartare le mosche dopo tre modifiche.
   1. Posizionare le bottiglie all'interno dell'incubatrice sotto 12-h luce/12-h cicli scuri con una temperatura costante di 25 ° C.
      Nota: Una nuova generazione di mosche sarà eclose dopo dieci giorni.
2. Anestetizzare appena obtecta mosche sui rilievi di anidride carbonica per un massimo di 4 min e raccoglierli in fiale di allevamento volare 2.5 x 9.5 cm con 6,5 mL di terreno di volare utilizzando un pennello.
   1. Raccogliere solo Vergine mosche e separarli dal sesso in gruppi di 20 mosche al flaconcino di allevamento.
   2. Posizionare le fiale all'interno di incubatori per 5-7 giorni, cambiando le mosche a new Fiale ogni 2-3 giorni e nei giorni che precedono gli esperimenti.

3. cornice di luci

1. Fare un telaio in legno di 10 cm di lunghezza, 4 cm di larghezza, altezza 4 cm e 0,5 cm di spessore.
2. Su ciascuno dei lati corti, creare un bordo di 4 cm di lunghezza, 4 cm di altezza e larghezza di 1,5 cm verso l'interno area del telaio in legno. Lasciare la faccia interna del bordo aperto.
3. Praticare due fori di diametro di 0,5 cm all'intersezione di uno dei bordi lunghi del telaio in legno e in ciascuna delle frontiere presso i bordi corti.
4. Posto 10 cm di una striscia di LED bianca calda all'interno di ognuna delle frontiere sui bordi corti. Sbucciare il retro della striscia LED per incollarla immediatamente.
   Nota: Per gli esperimenti in cui illuminazione dovrà essere eliminato, può essere sostituito con la striscia di LED bianca calda LED infrarossi strisce.
5. Collegare un'estremità della striscia LED in uno dei bordi per l'alimentazione elettrica di commutazione e sua altra estremità verso la striscia di LED sul bordo opposto.
6. Accendere l'alimentazione elettrica di commutazione per verificare che entrambe le strisce LED si accende.
7. Coprire il lato aperto di ciascun bordo con un pezzo di carta bianca.
8. Incollare un altro pezzo di carta per ciascuna delle fasi interne dei bordi lunghi.

4. temperatura controllata Arena

1. Accendere l'arena a temperatura controllata (Figura 1A e 1C). Assicurarsi che la ventola inizia a funzionare e l'anello di alluminio si scalda.
2. Utilizzare un cavo USB per collegare l'arena temperatura controllata al computer di controllo che esegue lo script di TemperaturePhases con le sequenze di temperatura.
3. Aprire lo script di TemperaturePhases nel computer di controllo e verificare che la sequenza di temperatura sia impostata correttamente (Video 1).
   1. Verificare che la durata di ogni fase sperimentale è impostata su 60 s verificando che "par. StimulusDur"è uguale a 60 s.
   2. Controllare che il numero 1) uguale al numero di fasi, 2) iterativi ON/OFF set-up della luce rossa indicativa diodi (LED), aumento di temperatura 3) 2 ° C per fase, desiderato e 4) 16 ° C come temperatura di partenza sono tutte corrette sotto "Start sperimentale sezione di blocco".
      Nota: Lasciare le mosche di acclimatare all'Arena Vola per 7 min a 16 ° C per evitare un aumento artificiale delle velocità durante le prime fasi sperimentali (Figura 2).
   3. Eseguire lo script TemperaturePhases . Il software verrà inizializzato per 5 secondi come determinato nella "arena. Attendere"e poi si fermano.
   4. Premere la barra spaziatrice della tastiera per iniziare l'esecuzione delle fasi sperimentali, una volta che una Mosca è stata soffiata nell'Arena volare (punto 5.3).
      Nota: Il TemperaturePhases è lo script corrente controllando la casella; Tuttavia, è possibile creare altri script personalizzati per utilizzare questo dispositivo per regolare i requisiti di diversi esperimenti.
4. Collegare la fotocamera in cima l'arena per il computer di registrazione utilizzando il cavo USB della fotocamera.
5. Aprire il programma di registrazione video (Vedi Tabella materiali) del computer di registrazione selezionando "File | Nuova registrazione filmato". Si aprirà una schermata che mostra l'immagine dalla fotocamera.
   1. Assicurarsi che l'immagine della telecamera cattura tutti i bordi dell'arena e i LED rossi indicativi.
   2. Avviare la registrazione premendo il pulsante rosso al centro del bordo inferiore dello schermo che mostra l'immagine della telecamera dopo aver impostato il telaio delle luci intorno all'arena (punto 5.4).
      Nota: piccoli cambiamenti nell'illuminazione può influenzare la precisione del tracking. Si consiglia di mantenere costante l'illuminazione dell'arena temperatura controllata fissando la posizione dell'apparato.

5. temperatura esperimenti comportamentali

1. Preparare l'Arena Vola (Figura 1).
   1. Mettere un filo di nastro conduttivo bianco nella parte superiore le tegole di rame, garantendo che tutti i bordi sono coperti.
   2. Posizionare l'anello di alluminio riscaldata intorno le tegole di rame. Il bordo dell'anello si adatta perfettamente intorno le tegole di rame così si trova sempre nella stessa posizione.
   3. Pulire il vetro con un panno pulito e posizionarlo sulla parte superiore l'anello di alluminio, lasciando un buco attraverso il quale una Mosca può essere saltata in.
      Nota: Prima degli esperimenti, ricoprire il coperchio di vetro con l'agente di siliconatura per creare una superficie scivolosa. Applicare l'agente siliconatura per 24 h e sciacquarlo con acqua prima dell'uso.
2. Eseguire lo script TemperaturePhases (punto 4.3.3) e aprire il programma di registrazione video (punto 4.5).
3. Colpo al volo da un flaconcino di allevamento (punto 2.2.2) nell'Arena Vola (ad es., 1 maschio volare nella Figura 3).
   1. Prendere un flacone di mosche dall'incubatrice, toccare due volte per costringerli ad andare fino in fondo, intercettare una Mosca con un aspiratore di bocca e chiudere la fiala e rimetterlo in incubatrice.
   2. Posto al volo nell'arena attraverso il divario che è stato lasciato tra la copertura in vetro e alluminio anello (punto 5.1.3).
   3. Colmare il divario tra la copertura in vetro e alluminio anello spingendo il coperchio di vetro fino a quando non viene raggiunto il bordo dell'anello in alluminio, non appena la Mosca è stato introdotto nell'Arena di volare.
4. Posizionare il telaio delle luci intorno all'arena per garantire illuminazione simmetrica.
   1. Contrassegnare la posizione (ad es., usando un pennarello indelebile) del telaio di luci intorno all'Arena di volare (Figura 1) per garantire che il telaio è sempre posizionato nella stessa posizione.
5. Avviare la registrazione con il programma di registrazione video (punto 4.5.2) e premere la barra spaziatrice sulla tastiera del computer di controllo per iniziare l'esecuzione delle fasi sperimentali (passo 4.3.4).
6. Fasi sperimentali dopo tutto finiti, salvare il video in formato. MP4 o AVI e rimuovete il fly dall'Arena Vola con l'aspiratore di bocca.
   Nota: La fine delle fasi sperimentali può essere determinata da entrambi i LED rossi indicativi vengono disattivati o l'arresto di script di TemperaturePhases .
   1. Interrompere la registrazione premendo il pulsante di stop al centro del bordo inferiore dello schermo nel programma di registrazione video. Premere "File | Salva con nome"per salvare il video.

6. video di rilevamento e analisi dei dati

1. Utilizzare il FlySteps (Video 2) software di monitoraggio per monitorare i video.
   1. Aprire il "configuration_file.ini" all'interno della cartella "FlyTracker".
   2. Impostare il percorso dei video in "video_folder" e i nomi dei video in "video_files".
   3. Specificare i bordi dell'Arena volare in "arena_settings" basato su (x, y) le coordinate in pixel di più punti ai margini dell'arena.
   4. Specificare la posizione dei LED rossi indicativo in "led_settings" basato su (x, y) le coordinate in pixel della posizione del centro dei LED.
   5. Controllare la posizione dei bordi dell'Arena volare impostando "debug" su "true" in "arena_settings", cliccando su "Salva" e in esecuzione lo script nel terminale. Una cattura dello schermo del video verrà visualizzata con un quadrato blu formato dalle coordinate immessi in "arena_settings".
      Nota: Questa piazza non circonda l'area da rilevare.
   6. Modificare "debug" in "arena_settings" a "false", fare clic su "Salva" ed eseguire ancora una volta sullo schermo nel terminale.
      Nota: Questo avvierà il processo di rilevamento.
      Nota: Mosche possono camminare fuori della zona di rilevamento sull'anello di alluminio riscaldata. Questo accade durante i primi secondi di un esperimento, dopo di che mosche smettere di toccare l'anello riscaldata e rimangono all'interno dell'area di rilevamento.
      Nota: Il video può essere rintracciato con altri software di monitoraggio in base alle preferenze dello sperimentatore.
2. Uso (x, y) posizione di ogni fly fornito dal software di monitoraggio per calcolare la misura di interesse per le prestazioni di temperatura. Script personalizzati (ad es., FlyStepsAnalysis in integrativa) può essere utilizzato.
3. Confrontare le curve di prestazione di temperatura dei vari gruppi a volare utilizzando misurazioni ripetute (RM) analisi della varianza (ANOVA) e post-hoc confronti multipli utilizzando il software statistico (Vedi Tabella materiali).

Risultati

L'arena a temperatura controllata (Figura 1A) è costituito da tre tegole di rame cui la temperatura può essere autonomamente attraverso un circuito programmabile. Ogni piastrella rame possiede un sensore di temperatura che fornisce un feedback al circuito programmabile. Il circuito si attiva un alimentatore per aumentare la temperatura di ogni piastrella. Elementi passivi termoelettrici fungono da elementi di riscaldamento costante per mantenere la temperat...

Discussione

Qui abbiamo presentato un'arena automatizzata temperatura controllata (Figura 1) che produce i cambiamenti di temperatura preciso nel tempo e nello spazio. Questo metodo permette l'esposizione di singoli Drosophila non solo pre-programmati aumento graduale della temperatura (Figura 2 e Figura 3), ma anche a sfide di temperatura dinamico in cui ogni mattonelle dell'arena Vola era riscaldata in modo indipendente ad una temper...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Due	Arduino	A000062	Software RUG
Electronics Board	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-Main-02-2014
Power supply Boost	XP-Power 48. V 65 W	ECS65US48	Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating	XP-Power 15. V 80 W	VFT80US15
Power supply Cooling	XP-Power 15. V 130 W	ECS130U515
Peltier elements	Marlow Industries	RC12-4	2 Elements, controlled DC feed
Heat sink	Fisher Technik	LA 9/150-230V	Decoupled for vibration
Temperature sensors	Measurement Specialties	MCD_10K3MCD1	Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-CB-01-2014
Auminum ring	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm	RS Components	111-2300	White conductive tape
Red LEDs	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip	Ledstripkoning	HQ-3528-SMD	60 LEDs per meter
Switch Power Supply	Generic	T-36-12
Logitech c920	Logitech Europe S.A	PN960-001055
QuickTime Player	Apple Computer		Recording program
Tracking analysis software	R		Packages: pacman
Tracking analysis software	MATLAB
Thermal Imaging	FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software	Graph Pad Prism
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML	Siliconising agent
Fly rearing bottles	Flystuff	32-130	6oz Drosophila stock bottle
Flypad	Flystuff	59-114
Fly rearing vials	Dominique Dutscher	789008	Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator	Sanyo	MIR-154
Magnetic hot plate	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic Ingredients B.V.	010001.26.0
Glucose	Gezond&wel	1019155	Dextrose/Druivensuiker
Sucrose	Van Gilse		Granulated sugar
Cornmeal	Flystuff	62-100
Wheat germ	Gezond&wel	1017683
Soy flour	Flystuff	62-115
Molasses	Flystuff	62-117
Active dry yeast	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%