Eine automatisierte Methode zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Drosophila als Reaktion auf Temperaturänderungen in Raum und Zeit

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.

Zusammenfassung

Temperatur ist eine allgegenwärtige Umweltfaktor, das betrifft wie Arten verteilen und Verhalten. Verschiedene Arten von Drosophila Fruchtfliegen haben spezifische Reaktionen auf wechselnde Temperaturen entsprechend ihrer physiologischen Toleranz und Anpassungsfähigkeit. Drosophila -fliegen besitzen auch eine Temperatur sensing-System, die grundlegend für das Verständnis der neuronalen Grundlagen der Temperatur, die Verarbeitung in Kaltblütler geworden ist. Wir stellen Ihnen hier eine temperaturgeführte Arena, die schnelle und präzise Temperaturänderungen mit zeitlichen und räumlichen Steuerung, die Reaktion der einzelnen fliegen zu erkunden, wechselnde Temperaturen zulässt. Einzelne fliegen sind in der Arena platziert und vorprogrammierte Temperatur Herausforderungen ausgesetzt, wie einheitliche schrittweise Temperatur Reaktion Normen bestimmen oder räumlich verteilten Temperaturen gleichzeitig Vorlieben bestimmen erhöht. Einzelpersonen werden automatisch erfasst und erlauben die Quantifizierung der Geschwindigkeit oder Standort bevorzugt. Diese Methode kann verwendet werden, um schnell die Antwort über eine große Auswahl an Temperaturen Leistung Temperaturkurven in Drosophila bestimmen oder andere Insekten von ähnlicher Größe zu quantifizieren. Darüber hinaus kann es für genetische Studien verwendet werden, um Temperatur-Einstellungen und Reaktionen der Mutanten und Wildtyp fliegen zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, die Grundlage der thermischen Speziation und Anpassung sowie die neuronalen Mechanismen hinter Temperatur Verarbeitung aufzudecken.

Einleitung

Temperatur ist eine Konstante Umweltfaktor, das betrifft, wie Organismen funktionieren und¹Verhalten. Unterschiede in Breite und Höhe führen zu Unterschieden in der Art des Organismus ausgesetzt sind, die Ergebnisse in evolutionäre Auswahl für ihre Reaktionen auf Temperatur^2,3Klimazonen. Organismen reagieren auf unterschiedliche Temperaturen durch morphologischen, physiologischen und verhaltensbezogenen Anpassungen, die maximale Leistung unter ihre besondere Umgebungen-⁴. Zum Beispiel haben in der Taufliege Drosophila Melanogaster, Populationen aus verschiedenen Regionen unterschiedliche Temperatur-Einstellungen, Körpergrößen, Entwicklungsstörungen Times, Langlebigkeit, Fruchtbarkeit und walking Leistung bei unterschiedlichen Temperaturen^{2 ,5,6,7}. Die Vielfalt zwischen fliegen unterschiedlicher Herkunft beobachtet wird teilweise durch genetische Variation und Kunststoff Gen Ausdruck^8,9erklärt. In ähnlicher Weise Drosophila -Arten aus verschiedenen Bereichen Temperaturgradienten anders verteilen und zeigen Unterschiede im Widerstand zu extremer Hitze und Kälte Tests^10,11,12.

Drosophila ist vor kurzem auch das Modell der Wahl zu verstehen, die genetischen und neuronalen Grundlagen der Temperatur Wahrnehmung^{13,14,15,16,17}geworden. Im großen und ganzen wahrnehmen Erwachsene fliegen Temperatur, durch kalte und warme periphere Temperatur-Sensoren in die Antennen und Temperatursensoren im Gehirn^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. die Peripherie-Rezeptoren für heiße Temperaturen auszudrücken, Gr28b.d¹⁶ oder Pyrexie²¹, während die Peripherie Kälterezeptoren zeichnen sich durch Brivido¹⁴. Im Gehirn wird die Temperatur von Neuronen, die mit dem Ausdruck TrpA1¹⁵verarbeitet. Verhaltensstudien an Mutanten dieser Wege sind besser zu verstehen wie Temperatur verarbeitet wird und geben Einblicke in die Mechanismen, die Populationen von Drosophila aus verschiedenen Regionen sehr unterschiedlich sind.

Hier beschreiben wir eine temperaturgeführte Arena, die schnelle und präzise Temperaturänderungen produziert. Die Ermittler können diese Änderungen vorprogrammieren ermöglicht die standardisierte und reproduzierbare Temperatur Manipulationen ohne menschliches Zutun. Fliegen sind erfasst und verfolgt mit Spezialsoftware ihre Position und Geschwindigkeit in verschiedenen Phasen eines Experiments bestimmen. Der Messbildschirm präsentiert in diesem Protokoll ist die Gehgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperaturen, weil es ein ökologisch relevanter Index der physiologischen Leistungsfähigkeit, die einzelnen thermischen Anpassungsfähigkeit⁵identifizieren können. Zusammen mit Temperatur-Rezeptor Mutanten kann diese Technik helfen, die Mechanismen der thermischen Anpassung auf zelluläre und biochemische Ebene zeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung des Mediums fliegen Essen

1. Gießen Sie 1 L Leitungswasser in einem 2 L Becherglas und fügen Sie eine magnetische Stir Bar. Setzen Sie den Becher auf einer magnetischen Herdplatte bei 300 ° C, bis Siedetemperatur erreicht ist.
2. Rühren Sie mit 500 Schuss/min und fügen Sie die folgenden: 10 g Agar, 30 g Glukose, 15 g Saccharose, 15 g Maismehl, 10 g Weizenkeime, 10 g Sojamehl, 30 g Melasse und 35 g aktive trockene Hefe.
3. Wenn die Mischung kräftig schäumt, drehen Sie die Herdplatte Temperatur 120 ° c weiter rühren.
4. Schalten Sie die Herdplatte Temperatur weiter auf bis zu 30 ° C nach 10 min und weiter rühren, bis die Mischung bis 48 ° C kühlt. Messen Sie die Temperatur, indem man einen Thermometer direkt in das Essen ohne Berührung der Wände des Bechers.
5. Lösen Sie 2 g p-hydroxy-Benzoesäure Acid Methylester in 10 mL Ethanol 96 auf % und fügen Sie es auf die Mischung, zusammen mit 5 mL 1 M Propionsäure. Weiter rühren 3 Minuten lang.
6. Die Kochplatte ausschalten und 45 mL von Lebensmitteln in die Aufzucht Flaschen und 6,5 mL Nahrung in die Sammlung Fläschchen füllen.

2. Vorbereitung der fliegen

1. Platz 20 Männer und 20 Frauen fliegt in die Aufzucht Flaschen mit 45 mL fliegen Essen Medium. Übertragen Sie die fliegen zu neuen Flaschen nach 3 bis 4 Tagen durch Tippen sie nach unten und dann tippen sie in die frische Flaschen. Verwerfen Sie die fliegen nach drei Änderungen.
   1. Flaschen Sie die in die brutmaschine unter 12 h Licht/12-h dunkel Zyklen mit einer konstanten Temperatur von 25 ° C.
      Hinweis: Eine neue Generation von fliegen wird Eclose nach zehn Tagen.
2. Neu betäuben Sie geschlüpften fliegen auf Kohlendioxid-Pads für bis zu 4 min zu und sammeln sie in 2,5 x 9,5 cm fliegen Aufzucht Fläschchen mit 6,5 mL fliegen Essen Medium mit einem Pinsel.
   1. Sammeln Sie nur native fliegen zu und trennen Sie sie in Gruppen von 20 fliegen pro Fläschchen Aufzucht nach Geschlecht.
   2. Legen Sie die Fläschchen in Inkubatoren für 5-7 Tage, die fliegen zu ändern, um neue Fläschchen alle 2-3 Tage und an den Tagen zuvor Experimente.

3. Rahmen der Lichter

1. Machen Sie einen Holzrahmen von 10 cm Länge, 4 cm breit und 4 cm Höhe 0,5 cm dick.
2. Auf jeder der die kurzen Kanten, erstellen Sie einen Rand von 4 cm Länge, 4 cm Höhe und 1,5 cm breit nach innen Bereich des hölzernen Rahmens. Lassen Sie die Innenseite des Grenze geöffnet.
3. Bohren Sie zwei Löcher von 0,5 cm Durchmesser an der Kreuzung eines langen Kanten des hölzernen Rahmens und an den Grenzen an den kurzen Kanten jeweils.
4. Platz 10 cm einen warmen weißen LED Streifen innerhalb der einzelnen die Grenzen auf die kurzen Kanten. Schälen Sie die Rückseite des LED-Streifens, kleben sie sofort an Ort.
   Hinweis: Streifen für Experimente in die Beleuchtung, die muss beseitigt werden, die warme weiße LED-Streifen für Infrarot-LED ersetzt werden kann.
5. Schließen Sie ein Ende des LED-Streifens in den Rand das Schaltnetzteil und seinem anderen Ende in den LED-Streifen auf der gegenüberliegenden Grenze.
6. Schalten Sie das Schaltnetzteil um sicherzustellen, dass beide LED-Strips einschalten.
7. Decken Sie die offene Seite des jeden Rand mit einem weißen Blatt Papier.
8. Kleben Sie ein Stück Papier auf den internen Phasen von den langen Kanten.

4. temperaturgeführte Arena

1. Schalten Sie die temperaturgeführte Arena (Abb. 1A und 1 C). Stellen Sie sicher, dass der Lüfter beginnt zu laufen und die Aluminium-Ring beginnt Aufwärmen.
2. Verwenden Sie ein USB-Kabel, um die temperaturgeführte Arena an den Steuerrechner der TemperaturePhases Skriptausführung mit der Temperaturverläufe verbinden.
3. Öffnen Sie das Skript TemperaturePhases in dem Steuerungsrechner und stellen Sie sicher, dass der Temperaturverlauf (Video 1) ordnungsgemäß eingerichtet ist.
   1. Prüfen, ob die Dauer der einzelnen Experimentierphase ist auf 60 s durch die Überprüfung dieser "Par. StimulusDur"entspricht 60 s.
   2. Überprüfen Sie, dass die Zahl 1) gleich gewünscht Anzahl der Phasen, 2) iterative ein-/Aufbau der indikativ rotes Licht emittierende Dioden (LEDs), (3) 2 ° C Temperaturerhöhung pro Phase, und (4) 16 ° C als der Starttemperatur sind alle richtig unter die "Start der experimentellen "Blockabschnitt.
      Hinweis: Lassen Sie die fliegen zu akklimatisieren, fliegen Arena für 7 min bei 16 ° C, eine künstliche Erhöhung der Geschwindigkeit während der ersten experimentellen Phasen (Abbildung 2) zu vermeiden.
   3. Das TemperaturePhases -Skript ausführen. Die Software wird für 5 Sekunden wie im "Arena. initialisieren. Warten"und dann wieder gestoppt.
   4. Drücken Sie die Leertaste der Tastatur geschaltet, die experimentelle Phasen einmal eine Fliege in die Arena zu fliegen (Schritt 5.3) gesprengt hat.
      Hinweis: Die TemperaturePhases ist das aktuelle Skript, das Feld zu kontrollieren; Es ist jedoch möglich, andere benutzerdefinierte Skripts für die Verwendung dieses Geräts zu erstellen, die Anpassung an die Anforderungen der verschiedenen Experimente.
4. Schließen Sie die Kamera auf die Arena zum aufnehmenden Computer mit USB-Kabels der Kamera.
5. Öffnen Sie das video-Aufnahme-Programm (siehe Tabelle of Materials) in den Aufnahme-Computer durch Auswahl von "Datei | Neue Filmaufnahme". Es öffnet sich ein Bildschirm zeigt das Bild von der Kamera.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Kamerabild alle Kanten der Arena und die indikativen roten LEDs erfasst.
   2. Die Aufnahme durch Drücken des roten Knopfes in der Mitte des Bildschirms Unterkante das Kamerabild angezeigt, sobald der Rahmen der Lichter rund um die Arena (Schritt 5.4) festgelegt ist.
      Hinweis: kleine Änderungen in der Beleuchtung beeinflussen die Genauigkeit der Nachführung. Es empfiehlt sich, die Beleuchtung der temperaturgeführten Arena konstant zu halten, durch die Festlegung der Lage des Apparates.

(5) Temperatur Verhaltensexperimente

1. Bereiten Sie die Fliege Arena (Abbildung 1).
   1. Legen Sie einen Strang von weißen leitfähigen Bändern auf der Oberseite der Kupfer Fliesen, sicherzustellen, dass alle Kanten abgedeckt sind.
   2. Legen Sie den beheizten Aluminium Ring um das Kupfer Fliesen. Der Rand des Ringes passt perfekt um das Kupfer Fliesen, so dass es immer an der gleichen Stelle platziert wird.
   3. Reinigen Sie die Glasabdeckung mit einem sauberen Tuch und legen Sie es auf der Oberseite der Alu-Ring, so dass eine Lücke, durch die eine Fliege eingeblasen werden kann.
      Hinweis: Vor den versuchen Mantel der Glasdeckel mit dem siliconizing Agent, eine glatte Oberfläche zu schaffen. Gelten Sie die siliconizing Agents für 24 h und spülen sie mit Wasser vor dem Gebrauch.
2. Führen Sie das Skript TemperaturePhases (Schritt 4.3.3) und öffnen Sie das video-Aufnahme-Programm (Schritt 4.5).
3. Schlag die Fliege von einem Aufzucht Fläschchen (Schritt 2.2.2) in der Arena fliegen (zB., 1 männliche fliegen in Abbildung 3).
   1. Nehmen Sie ein Fläschchen mit fliegen aus dem Inkubator, tippen sie zweimal, um zwingen, gehen nach unten, fangen eine Fliege mit einer Mund-Sauger, und schließen Sie das Fläschchen und setzen Sie ihn wieder in den Brutkasten.
   2. Legen Sie die Fliege in der Arena durch den Spalt, der zwischen dem Glasdeckel und Alu-Ring (Schritt 5.1.3) gelassen hat.
   3. Schließen Sie die Lücke zwischen Glasabdeckung und Alu-Ring durch die Glasabdeckung zu drücken, bis es erreicht den Rand der Alu-Ring, wie die Fliege fliegen Arena eingeführt wird.
4. Legen Sie den Rahmen der Lichter rund um die Arena zu symmetrischen Ausleuchtung zu gewährleisten.
   1. Markieren Sie die Stelle (zB., mit einem wasserfesten Filzstift) des Rahmens der Lichter rund um die fliegen Arena (Abbildung 1) um sicherzustellen, dass der Rahmen immer an der gleichen Stelle platziert wird.
5. Starten Sie die Aufnahme mit dem video-Aufnahme-Programm (Schritt 4.5.2) und drücken Sie die Leertaste auf der Tastatur des Steuerrechners, die experimentelle Phasen (Schritt 4.3.4) geschaltet.
6. Nachdem alle experimentelle Phasen fertig sind, speichern Sie das Video in MP4 oder AVI-Format und die Fliege aus der Arena fliegen mit der Mund-Sauger entfernen.
   Hinweis: Am Ende der experimentellen Phasen kann bestimmt werden durch beide indikative rote LEDs ausgeschaltet oder durch das TemperaturePhases Skript anhalten.
   1. Die Video-Aufnahme durch Drücken der Stop-Taste in der Mitte des Bildschirms Unterkante in die Aufnahme-Programm zu stoppen. Presse "Datei | Speichern unter"um das Video zu speichern.

6. Video Tracking und Analyse von Daten

1. Verwenden Sie die FlySteps tracking-Software (Video 2) um die Videos zu verfolgen.
   1. Öffnen Sie die "configuration_file.ini" innerhalb des Ordners "FlyTracker".
   2. Legen Sie den Speicherort der Videos in "Video_folder" und die Namen der Videos in "Video_files".
   3. Geben Sie die Grenzen der fliegen Arena in "Arena_settings", basierend auf (X, y) Pixelkoordinaten von mehreren Punkten am Rand der Arena.
   4. Geben Sie den Speicherort der indikativ rote LEDs in "Led_settings", basierend auf (X, y) Pixelkoordinaten der Position des Centers der LEDs.
   5. Überprüfen Sie den Speicherort der Grenzen der Arena fliegen durch die Festlegung "debug" auf "True" in "Arena_settings", "Speichern" klicken, und das Skript im Terminal ausführen. Ein Screenshot des Videos erscheint mit einem blauen Quadrat gebildet von den Koordinaten im "Arena_settings" eingegeben.
      Hinweis: Dieser Platz umgibt den Bereich verfolgt werden.
   6. In "Arena_settings" auf "False" ändern Sie "debug", klicken Sie auf "Speichern", und führen Sie den Bildschirm einmal mehr im Terminal.
      Hinweis: Dadurch wird den Tracking-Prozess gestartet.
      Hinweis: Fliegen können aus dem Tracking-Bereich auf der beheizten Alu-Ring gehen. Dies geschieht während der ersten Sekunden eines Experiments, nach dem Fliegen nicht mehr berühren den beheizten Ring und bleiben in das Fährtengelände.
      Hinweis: Videos können mit anderen Tracking-Software nach der Experimentator Vorlieben nachverfolgt werden.
2. Verwendung der (X, y) Lage des jede Fliege von der Tracking-Software zu berechnen, das Maß an Interesse für die Temperatur-Leistung zur Verfügung gestellt. Benutzerdefinierte Skripts (zB., FlyStepsAnalysis in ergänzende) verwendet werden.
3. Vergleichen Sie Leistung Temperaturkurven verschiedener fliegen Gruppen mit wiederholten Messungen (RM) Varianzanalyse (ANOVA) und Post-hoc- multiple Vergleiche mit Statistiksoftware (siehe Tabelle der Materialien).

Ergebnisse

Die temperaturgesteuerten Arena (Abbildung 1A) besteht aus drei Kupfer Fliesen, deren Temperatur durch eine programmierbare Schaltung individuell gesteuert werden kann. Jede Kachel Kupfer besitzt einen Temperatursensor, der Feedback an die programmierbare Schaltung gibt. Die Schaltung aktiviert eine Stromquelle, um die Temperatur jeder Fliese zu erhöhen. Passive thermoelektrische Elemente fungieren als Konstante Heizelemente, die gewünschte Temperatur beizu...

Diskussion

Hier haben wir eine automatische Temperaturkontrolle Arena (Abbildung 1) präsentiert, die präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert. Diese Methode ermöglicht die Belichtung der einzelnen Drosophila nicht nur vorprogrammierte schrittweise Erhöhung der Temperatur (Abbildung 2 und Abbildung 3), sondern auch dynamische Temperatur Herausforderungen in dem jede Kachel der Fliege Arena erhitzt wurde unabhängig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Due	Arduino	A000062	Software RUG
Electronics Board	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-Main-02-2014
Power supply Boost	XP-Power 48. V 65 W	ECS65US48	Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating	XP-Power 15. V 80 W	VFT80US15
Power supply Cooling	XP-Power 15. V 130 W	ECS130U515
Peltier elements	Marlow Industries	RC12-4	2 Elements, controlled DC feed
Heat sink	Fisher Technik	LA 9/150-230V	Decoupled for vibration
Temperature sensors	Measurement Specialties	MCD_10K3MCD1	Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-CB-01-2014
Auminum ring	Ruijsink Dynamic Engineering	FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm	RS Components	111-2300	White conductive tape
Red LEDs	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip	Ledstripkoning	HQ-3528-SMD	60 LEDs per meter
Switch Power Supply	Generic	T-36-12
Logitech c920	Logitech Europe S.A	PN960-001055
QuickTime Player	Apple Computer		Recording program
Tracking analysis software	R		Packages: pacman
Tracking analysis software	MATLAB
Thermal Imaging	FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software	Graph Pad Prism
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML	Siliconising agent
Fly rearing bottles	Flystuff	32-130	6oz Drosophila stock bottle
Flypad	Flystuff	59-114
Fly rearing vials	Dominique Dutscher	789008	Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator	Sanyo	MIR-154
Magnetic hot plate	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic Ingredients B.V.	010001.26.0
Glucose	Gezond&wel	1019155	Dextrose/Druivensuiker
Sucrose	Van Gilse		Granulated sugar
Cornmeal	Flystuff	62-100
Wheat germ	Gezond&wel	1017683
Soy flour	Flystuff	62-115
Molasses	Flystuff	62-117
Active dry yeast	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%