cd4+ t 细胞的分离及6色流式细胞仪分析外周血中循环 t-滤泡 (ctfh) 细胞亚群

摘要

本文介绍了一种从人外周血中分离和表征 cd4 + t 细胞亚群的方法。采用流式细胞仪对纯化的 cd4⁺ t 细胞进行分析, 以确定 t-滤泡辅助细胞亚群的比例。

摘要

在自身免疫性条件下检测到 t-滤泡辅助细胞 (tfh) 细胞活性, 当分析 b 细胞非霍奇金淋巴瘤的淋巴结微环境时, 它们的存在与临床结果有关。循环 t-滤泡辅助细胞 (ctfh) 的子集, 血液中 tfh 细胞的循环记忆室, 也在疾病中受到干扰, 因此代表了潜在的新的预测生物标志物。周边血样检测是有利的, 因为它是相对非侵入性的, 并允许简单的串行监测。本文介绍了一种从人的血液中分离 cd4⁺ t 细胞的方法, 并通过流式细胞仪进一步分析, 以列举 ctfh 细胞及其各种子集的比例 (ctfphd-1-^/+/,ctfh1, 1, 17 和 ctfh一个半小时)。然后比较正常受试者和淋巴瘤患者之间这些亚群的水平。我们发现, 这种方法足够稳健, 可以从例行采集的病人材料中获得可靠的结果。我们描述的分析技术可以很容易地适应细胞分类和下游应用, 如 rt-pcr。

引言

t 型滤泡辅助细胞 (tfh) 是 cd4⁺ t 细胞亚群, 最初的特征是在淋巴组织¹中。这些细胞表达 pd-1 和 cxcr5 表面受体, 分泌 il-21 和 il-4, 并显示转录因子 bcl-6^2,3 的核表达。顾名思义, 它们存在于萌发中心, 对于高亲和力抗体的产生是必不可少的.

失调的 tfh 反应与疾病发病机制有关, 最显著的是自身免疫性疾病, 它们促进自反应 b 细胞⁴的扩张。它们还在固体^{5、6 和}淋巴癌7的肿瘤微环境中发挥作用。相反, 表面蛋白的遗传缺陷是 tfh 功能所必需的, 如诱导 t 细胞共计器 (icos) 会导致人体免疫缺陷综合征8。人类外周血中的 cd4 + cTfh⁺细胞被称为循环 t 型滤泡辅助细胞 (ctfh), 被认为是^{组织 9}中 tfh 细胞的记忆室。本文所述方法的目的是分析 cd4 + 细胞分离后的 ctfh^亚群。

定义了几个 ctfh 子集, 它们提供 b 细胞帮助的效率因子集而异, 不同的子集为 9^{、10、11、12.}这些子集的相对比例在一些疾病中发生了变化, 最突出的是自身免疫性疾病, 在这些疾病中, 功能较大的 d-1^+/ hi 和/或 ctfh2 或 cTfh2 子集的相对增加与较少的亚群相比几乎总是相对增加。功能 pd-1^-和/或 ctfh1 子集¹²。这些变化的程度经常与临床参数有关, 包括疾病活动和自身抗体滴度, 这表明 ctfh 亚系分布作为疾病中的预后生物标志物具有潜在作用, 这可能反映了 tfh 在淋巴组织^9,12,13,14。此外, 从参与者身上采集血液样本是快速、安全和可接受的, 因此可以进行连续监测, 以分析疾病进展或对治疗的反应。

与传统外周血单个核细胞 (pbmnc) 悬浮液相比, 分离 cd4⁺ t 细胞的使用减少了获取大量 ctfh 细胞进行分析所需的时间, 从而实现了更高的吞吐量流式细胞仪实验。当使用流激活单元排序 (facs) 对罕见的 ctfh 子集中的单元格进行排序时, 这尤其有用。为了提高效率, 可以对这些悬浮液进行冷冻保存, 以便在流式细胞术实验中使用样品的 "批处理"。在试验中, 冷冻保存并没有降低 cd4⁺的纯度。

虽然不同的实验室在发现 ctfh 细胞的早期阶段使用不同的标记对其进行分类, 但这里提出的方法利用了 schmidt 等人提出的两组细胞表面标记的统一方案,¹⁵能够在一次流式细胞术实验中同时识别 ctfh 及其9个识别的子集。

由于只使用细胞表面标记物, 细胞不需要固定或渗透, 因此可以保持活力的下游功能研究。这可以通过使用具有相同抗体面板的流式细胞联症进行细胞分类来促进。该面板可以扩展到包括其他标记, 允许使用流式细胞仪的限制。

多色流式细胞术实验的分析可能具有挑战性, 因为在二维点图上的门控具有内在的主观性, 特别是当细胞群在标记荧光中没有一个明确的双模态分布时, 就像ctfh 细胞及其子集的情况。因此, 必须建立有效的控制措施, 以减少文物, 更好地解决民众问题, 并自信地制定门控战略。因此, 在步骤3.4.2 和3.4.3,respectively 中概述了流式细胞仪实验的抗体面板设计和基本控制的设置, 即使用补偿和 fmo 控制。

所有 ctfh 细胞被定义为 cd4⁺ cTfh⁺ cTfh^-。然后, 可以确定特征 tfh 激活标记 pd-1 的表达水平, 以确定^pd-1-、pd-1⁺或 pd-1 hi ctfh^单元的子集。然后, 使用传统的 th1, 2 或17细胞不同表达的趋化因子受体 cTfh 和 ccr6 的组合, ctfh 可以通过 cTfh⁺ ccr6^-, ccr6-, ccr3-ccr6^- -, 和 cccr3-ccr6⁺.

我们实验室使用的抗体面板显示在表 1中。用户可能需要调整其荧光体的选择, 以考虑其局部流式细胞仪上可用的激光和光过滤器配置。

以下考虑因素影响了荧光的选择。在可能的情况下使用明亮的荧光。特别是, 在最暗 (表达程度较低) 的标记上使用最亮的可用荧光。调光标记包括 pd-1、cxcr3 和 ccr6, 其次包括 cxcr5。我们专门利用较新的 bb、bv 和 buv 荧光, 提供出色的亮度, 从而更容易地解决细胞的不同种群。

尽可能地将荧光体的选择传播到发射光谱中, 以最大限度地减少光谱重叠, 从而降低所需的补偿水平。一个免费的在线工具, 可用于帮助设计流式细胞仪面板可以在这里找到: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer。为了节省发射光谱上的空间, 我们使用了一种 "转储通道", 使用的是具有与 apc-h7 (与 cd45ra 结合) 重叠的发射波长的可行染料, 以便能够检测 (和排除) 死亡和/或 cd45ra⁺ 。单探测器。

本文提出了一种分离外周血 cd4⁺ t 细胞的方案, 并随后通过流式细胞仪对其进行分析, 以确定不同的和最近描述的循环亚群的比例。

研究方案

从正常人 (ns) (n = 12) 以及边缘区淋巴瘤 (mzl) (n = 7) 和其他类型的 b 细胞非霍奇金淋巴瘤 (bnhl) (6 例 fl 患者、2例淋巴浆细胞淋巴瘤患者和1个低品位 b 细胞) 中提取血液样本非霍奇金淋巴瘤没有其他指定的病人)。在给予知情、书面同意并对所有研究进行道德认可的情况下, 从莱斯特皇家医务室的血液诊所招募了患者。莱斯特郡、北安普敦郡和鲁特兰研究伦理委员会1获得了道德批准, 病人样本的参考是 0q250. i 122, 卫生研究局 (hra) 委员会东 midlands-devce, 参考14/em/176正常科目。

1. 从全外周血中分离 cd4⁺ t 细胞

1. 通过标准静脉穿刺和工艺, 尽快将新鲜外周血(2 至15毫升) 放入 k2 edta 管中, 以保持最大的活力。
   请注意:使用标准的实验室个人防护设备 (外套、手套、眼镜), 并在二级生物安全柜中开展工作。
2. 将血液和所有必要的试剂 (cd4⁺浓缩鸡尾酒、2% 的胎牛血清磷酸盐缓冲盐水 (fbsbsp)、密度梯度培养基和冷冻介质 (如果冷冻保存细胞) 带到室温。
3. 将血液与市售的抗体混合物混合, 以丰富人类 cd4⁺ t 细胞。每1毫升血液使用50μl 试剂。使用50毫升锥形聚丙烯管5至15毫升的血液。
   请注意:如果使用2至4毫升的血液, 请在14毫升锥形聚丙烯管中执行此步骤。
4. 在室温下将混合物生也就是20分钟。
5. 用相同体积的 2% fbse/pbs 稀释混合物
6. 慢慢地将这种稀释的混合物分层在密度梯度介质的顶部, 以避免干扰界面, 并立即进行离心, 以避免血液扩散到密度梯度介质中。
   1. 对于2至3毫升的血液, 在14毫升锥形聚丙烯管中使用3毫升密度梯度介质, 但对于4毫升的血液, 在 14 ml 锥形聚丙烯管中使用4毫升密度梯度介质, 对于5至 15 ml 血液, 在50毫升锥形聚丙烯管中使用15毫升密度梯度介质。
7. 在 1200 x 克的温度下离心层状混合物 20分钟 , 在20°c 下关闭制动器。
   请注意:环境温度低于环境可能会导致红细胞和粒细胞的污染。较低的速度将导致 cd4⁺隔离过程失败。离开休息将减少细胞产量。使用工作台顶部离心机与转子, 可以关闭, 以避免气溶胶。
8. 使用巴斯德移液器从界面中取出浓缩的 cd4⁺细胞层。
   请注意:浓缩的细胞层将类似于白色多云细胞的标准 "蓬松涂层", 但由于只有 cd4⁺细胞存在, 这自然会更小, 更难看到。
9. 在 cd4⁺细胞中添加2% 的 fbsp, 总体积不超过10毫升, 然后用2% 的 fbsp 清洗两次, 每次清洗时以 400 x 克的速度离心 10分钟 。
10. 将颗粒重新放在2% 的 fbssp 中, 并对染色的细胞进行计数, 以确定细胞数量和活力。
11. 可选步骤: 在1毫升的 aliquots 中,在冷冻介质中重新悬浮 5 x 10 5 至 1 x 10 6 细胞 (fbs 中的二甲基亚硫酸为 10%)。
    请注意:某些表面标记的水平可能会通过低温保存和解冻来改变。因此, 对所有样品进行一致处理是非常重要的。为了最大限度地减少分析变量的差异, 本研究对样品进行了冷冻保存和配料分析。

2. 流式细胞仪

1. 在37°c 的水浴中快速解冻冷冻保存的 cd4⁺细胞, 并在预热介质中清洗一次 (rpmi 1640 + l-谷氨酰胺补充 10% fbs 和1x 青霉素链霉素)。
2. 将细胞加入9毫升的培养基中, 离心剂在 400 x克处 5分钟, 并去除上清液。
3. 在 pbs (50μl) 中重新移植1% 的牛血清白蛋白 (bsa) 中的细胞, 以便每个要测试的条件使用 5 x^{10 5}和 1 x 10^{6 的}细胞。
4. 将细胞与染色缓冲液 (50μl) 混合。
   注: 由于两种或两种染料固有的化学性质, 同时使用两个或两个以上的 bv 或 buv 污渍时, 明亮的污渍缓冲可防止可能干扰数据分析的各种染色制品。在单一或未染色条件下, 50μl 的明亮染色缓冲液可替代50μl 的 1% bsa/pbs。
5. 将抗体添加到细胞中 (根据表1中的 "使用量" 列), 在黑暗中在冰上孵育30分钟。
6. 每次清洗时, 以 600 x 克的速度离心 3分钟, 在 1% bsa/pbs 中清洗细胞两次。
7. 在 1% bsa/pbs (400μl) 中重新移植并转移到流式细胞仪采集管中。
8. 在获取流式细胞仪上的数据之前, 将细胞轻轻涡旋:

3. 流式细胞仪控制和设置

1. 使用未染色的样本, 设置光电二极管电压, 以便淋巴细胞可以从明显的碎片和死细胞 (具有高侧向散射 (ssc) 区域和低向前散射 (fsc) 区域的事件)¹⁶。使用单个染色样品, 设置光电倍增管 (pmt) 电压, 以便从背景荧光中识别出正荧光, 同时确保所有事件都在可检测的范围内。
   请注意:改进的方法是使用模糊荧光磁珠绘制每个 pmt 电压的 cv 图, 以找到最佳分辨率的最小电压 ("峰值 2" 法¹⁹)。
2. 通过使用带有捕获珠的单个污渍生成补偿矩阵来考虑光谱重叠。在 1% bsa/pbs (100μl) 和涡旋中加入市售补偿珠 (60μl) 和负控制珠 (60μl)。
   请注意:所使用的捕获珠子必须与所使用抗体的宿主物种和 igg 同型相匹配。如果任何串联染料的批号发生变化, 则应重新计算补偿矩阵, 因为它们在批次之间的发射光谱会显示出相当大的变化。
3. 加入单一抗体 (20μl) 和涡旋。
4. 在室温下在黑暗中孵化30分钟。
5. 以 200 x克离心 10分钟, 并丢弃上清液。
6. 在 1μp bs (500μl) 和涡旋中进行再利用。
7. 根据制造商的说明, 使用采集软件中指定的补偿矩阵发生器使用流式细胞仪采集样品。
8. 使用 fmo 控件来指导正标记荧光的门的放置, 以说明染料溢出的原因, 这是使用≥4色16的实验中背景荧光的主要来源。按照步骤3中描述的一般细胞表面染色协议, 但对于每个条件, 省略染色步骤中的一个荧光 (其中省略 cd45ra, 也省略活/死染色)。每种情况下获得 100, 000个淋巴细胞。
9. 将栅极阳性率设置为≤0.5% 的细胞。有关 fmo 控件的示例, 请参见图 2 。

4. 数据分析

1. 使用流式细胞仪的采集软件, 在 fsc 参数上设置 5, 000个单位的阈值, 以排除非常小的碎片。
2. 使用停止门获取 10, 000个 ctfh 细胞 (cd4⁺ cd45ra-cxcr5⁺).
   请注意:单个用户可以收集 10, 000多个单元格。这个数字是在收集足够的单元格以提供有意义的结果和收集所需的时间之间的妥协。
3. 使用 fsc-parta/ssc 面积点图, 绘制一个椭圆或多边形门, 以选择淋巴细胞的数量, 同时不包括碎片和公开死亡细胞 (ssc-a 区高、fsc 面积低的事件)。
4. 使用 fsc-fore/fsc-gow 点图, 绘制多边形门选择单个单元格, 同时排除双单元 (双面具有增加的面积, 但宽度与单个单元格相似)。
5. 使用 fsc 面积/cd45ra 和活力标记点图, 绘制一个矩形门选择活的 cd45ra^-细胞(细胞具有低荧光为这个标记)。
6. 使用 fsc 面积/cd4 点图, 绘制一个矩形门, 以选择 cd4⁺细胞 (此标记具有高荧光的细胞)。
7. 使用 cd4/cxcr5 点图, 绘制矩形门选择 cTfh⁺ (即 ctfh) 细胞 (此标记具有高荧光的细胞)。
8. 使用 cxcr3/ccr6 点图, 放置一个四门将 ctfh 细胞细分为 ctfh1, 2 和17单元 (每个标记的单元数都是高和低的)。
   请注意:表型 cd4⁺ cxcr5⁺ cxcr3⁺ ccr6⁺的细胞特征较差。我们将这些细胞称为 ctfh带^18,因为在 th17 和 th1 之间过渡的常规辅助 t 细胞(cd4⁺ cxcr5-) 显示了 cxcr3 和 ccr6 的表达, 并被描述为 ctfh一个半小时.
9. 使用 pd-1 直方图, 使用范围工具将 ctfh 细胞 (或如果愿意, 将单个 ctfh1, 17 或-17 子集) 细分为 pd-1^-/+或^hi人群。
   请注意:第 d-1⁺和 pd-1^{hi 之间}的区别在文献中没有得到很好的界定。阈值被设定为相同的 pd-1 强度所需的检测真正的 t直肠癌淋巴细胞悬浮液使用流式细胞仪与相同的抗体面板。或者, 可以将 icos 的标记添加到抗体面板中, 因为只有 pd1^{hi 细胞是 icos +}。

结果

cd4⁺隔离协议可实现高 cd4⁺纯度, 在我们检测的所有血液样本中都是可靠的 (均为: 966%, sd:2.38, ncos31) (图 3)。

给出了具有代表性的法题 ctfh (cd4⁺ cTfh⁺细胞) 的识别方法 (图 4a)。cd4⁺细胞中 ctfh 细胞的平均值为 29.4% (四分位间范围 (iqr) = 1...

讨论

该协议是一种分析外周血 ctfh 细胞的简单而有效的方法, 能够检测到迄今为止文献中确定的所有相关子集。血液样本可以很容易和有效地获得作为标准门诊诊所的一部分, 和系列样本可以收集平行的临床数据。反过来, 这使得前瞻性研究能够评估 ctfh 亚群作为疾病进展或治疗反应的生物标志物。这些研究将特别需要在疾病中, 其中 tfh 失调与发病机制有关, 如自身免疫和某些类型的固体和血液病癌症?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973