Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Resumo

Aqui, um protocolo para o isolamento e caracterização de CD4⁺ células T subconjuntos do sangue periférico humano é descrito. Purificado CD4⁺ T-células são analisadas por citometria de fluxo para determinar proporções de subconjuntos de célula auxiliar T-folicular.

Resumo

Aberrante atividade das células foliculares-T auxiliar (Tfh) é detectável em doenças auto-imunes e sua presença está associada com desfechos clínicos, quando se analisa o microambiente linfonodal em linfoma de células B não-Hodgkin. Subconjuntos de células T-foliculares auxiliar (cTfh), o compartimento de memória circulantes de células Tfh no sangue, que circula também são perturbados na doença e, portanto, representam potenciais novos biomarcadores preditivos. Teste baseado em sangue periférico é vantajoso porque é relativamente não-invasivo e permite monitoramento serial simples. Este artigo descreve um método para isolar CD4 + T-células do sangue humano e posterior análise por citometria de fluxo para enumerar as células cTfh e as proporções de seus vários subconjuntos (cTfhPD-1^{-/ + / Oi}, cTfh1, 2, 17 e cTfh1/17). O nível destes subconjuntos foi então comparado entre indivíduos normais e pacientes com linfoma. Descobrimos que o método era robusto o suficiente para obter resultados fiáveis de material paciente rotineiramente coletada. A técnica que descrevemos para a análise pode ser facilmente adaptada para celular classificação e aplicações a jusante como RT-PCR.

Introdução

Células T-foliculares de auxiliar (Tfh) são um CD4⁺ subconjunto de células T que caracterizou-se inicialmente em tecidos linfoides¹. Estas células expressam PD-1 e receptores de superfície CXCR5, secretam IL-21 e IL-4 e mostram expressão nuclear do fator de transcrição, BCL-6^2,3. Como seu nome sugere, eles são encontrados em centros germinativos e são essenciais para anticorpos de afinidade elevada produção¹.

Dysregulated Tfh respostas têm sido implicadas na patogênese da doença, mais notavelmente a doença auto-imune, onde eles promovem a expansão de células auto-reativas B⁴. Eles também desempenham um papel no microambiente do tumor do sólido^5,6 e cancros linfoides⁷. Por outro lado, defeitos genéticos de superfície proteínas essenciais para Tfh função como resultado de costimulator (ICOS) células T inducible em síndromes de imunodeficiência humana⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ células no sangue periférico humano são denominadas células helper T-foliculares (cTfh) de circulação e são acreditadas para ser o compartimento de memória das células Tfh em tecidos⁹. O objetivo do método descrito aqui é a análise de subconjuntos de cTfh seguindo CD4⁺ isolamento de amostras de sangue periférico de células.

Foram definidos vários subconjuntos de cTfh e a eficiência com que fornecem ajuda células B difere de um subconjunto para mais^9,10,11,12. As proporções relativas destes subconjuntos são alteradas em uma série de doenças, mais proeminentemente auto-imune em que lá é quase sempre um aumento relativo no mais funcional PD-1^{+ / Oi} e/ou subconjuntos de cTfh2 ou cTfh17 em comparação com os menos funcional PD-1^– e/ou subconjuntos de cTfh1¹². A extensão dessas mudanças frequentemente associar com parâmetros clínicos, incluindo títulos de atividade e auto-anticorpos doença, indicando um papel potencial de distribuição de subconjunto cTfh como biomarcador prognóstico na doença, que pode refletir a atividade da ESF no tecidos linfoides^9,12,13,14. Além disso, recolhendo amostras de sangue dos participantes é rápido, seguro e aceitável e então permite serial de monitoramento para a análise da progressão da doença ou resposta à terapia.

O uso de CD4 isolado⁺ de células T sobre suspensões de células mononucleares (PBMNC) de sangue periférico tradicional permite maiores experiências de citometria de fluxo da produção, reduzindo o tempo necessário para adquirir um número considerável de células de cTfh para análise. Isto é particularmente útil quando a classificação de células de cTfh rara subconjuntos usando fluxo ativado celular classificação (FACS). Para auxiliar a eficiência, estas suspensões podem ser criopreservadas para habilitar "lotes" de amostras a ser usado no experimento de citometria de fluxo. Em testes, o CD4⁺ pureza não foi reduzida em criopreservação.

Enquanto laboratórios diferentes usados diferentes marcadores para classificar cTfh células nos estágios iniciais de sua descoberta, o método apresentaram aqui faz uso de um regime unificado de dois grupos de marcadores de superfície celular como proposto por Schmidt et al.^{12, 15} para permitir a identificação simultânea de cTfh e seus subconjuntos reconhecidos nove em um único fluxo cytometry experimentar.

Como são usados apenas marcadores de superfície celular, as células não necessitam de fixação ou permeabilização e assim podem permanecer vivas para estudos funcionais a jusante. Isto poderia ser facilitado pela célula classificação usando FACS com o mesmo painel de anticorpos. Este painel pode ser expandido para incluir outros marcadores, permitindo as restrições do citômetro de fluxo sendo usado.

A análise das experiências de citometria de fluxo multi cor pode ser um desafio devido à natureza inerentemente subjetiva de gating em lotes do ponto 2-dimensional, especialmente quando populações de células não têm uma distribuição clara bi-modal na fluorescência do marcador, como é o caso para células cTfh e seus subconjuntos. Por esta razão, é imperativo para configurar os controles eficazes para reduzir os artefatos para permitir melhor resolução das populações e para definir a retenção de estratégias com confiança. Como tal, design de painel de anticorpos e a instalação de controles básicos para um fluxo cytometry experimentar, ou seja, usando a compensação e FMO controles estão descritas no passo 3.4.2 e 3.4.3,respectively.

Todas as células cTfh são definidas como CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. O nível de expressão do marcador característico de ativação Tfh PD-1 então pode ser determinado para identificar os subconjuntos do PD-1^-, PD-1⁺ ou PD-1^Oi cTfh células. Em seguida, usando uma combinação dos receptors do chemokine CXCR3 e CCR6, que são diferencialmente expressos pelo tradicional Th1, 2 ou 17 células, cTfh podem ser caracterizado como cTfh1, 2 ou 17-como por um perfil de CXCR3⁺ CCR6^-, CXCR3^– CCR6^- e CXCR3^– CCR6⁺, respectivamente.

O painel de anticorpos usado por nosso laboratório é exibido na tabela 1. O usuário pode ter para se adaptar a sua seleção de fluoróforo para contabilizar o laser e a configuração do filtro de luz disponível na sua citômetro de fluxo local.

As considerações a seguir influenciam a escolha de fluorophores. Sempre que possível, use fluorophores brilhante. Em particular, use o mais brilhante fluorophores disponível sobre as divisões mais marcadores (menos altamente expressas). Marcadores de redutor incluem PD-1, CXCR3 e CCR6 e em menor medida, CXCR5. Fizemos especificamente empreg o novo BB, BV e BUV fluorophores que proporcionam excelente brilho e assim permitir mais fácil resolução de populações distintas das células.

A seleção de fluoróforo espalharam os espectros de emissão tanto quanto possíveis minimizar a sobreposição espectral e, portanto, o nível de compensação pedida. Uma ferramenta online gratuita que pode ser usada para auxiliar a criação de um painel de citometria de fluxo pode ser encontrada aqui: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para economizar espaço no espectro de emissão, utilizamos um "canal de despejo" usando um corante de viabilidade com um comprimento de onda de emissão que se sobrepõe com os da APC-H7 (conjugados para CD45RA) para habilitar a detecção (e exclusão) de ambos mortos e/ou CD45RA⁺ usando um único detector.

Aqui, um protocolo é apresentado para o isolamento de sangue periférico CD4⁺ T-células e sua subsequente análise por citometria de fluxo para determinar as proporções dos diferentes e recentemente descrito subconjuntos de circulação.

Protocolo

Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos normais (NS) (n = 12) bem como pacientes com linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) e outros tipos de linfoma de células B não-Hodgkin (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma linfoplasmacítico e 1 baixo grau B-pilha Linfoma não-Hodgkin não especificados paciente). Os pacientes foram recrutados as clínicas de Hematologia no Leicester Royal enfermaria depois de ter dado consentimento, escrito, com aprovação ética no lugar em todos os estudos. Aprovação ética foi obtida por Leicestershire, Northamptonshire e Rutland pesquisa ética Comissão 1, 06/Q2501/122 de referência para as amostras dos pacientes e a autoridade de investigação de integridade (HRA) NRES Comité East Midlands-Derby, referência 14/EM/1176 para indivíduos normais.

1. isolamento de CD4⁺ T-células do sangue periférico inteiro

1. Tome sangue periférico fresco (2 a 15 mL) em tubos de EDTA K₂por venopunção padrão e processo logo que possível para manter a viabilidade máxima.
   Nota: Usar equipamento de proteção pessoal padrão de laboratório (casaco, luvas, óculos, etc.) e realizar o trabalho em uma classe II gabinete de biossegurança.
2. Trazer o sangue e todos os reagentes necessários (CD4⁺ enriquecimento cocktail, 2% fetal bovino soro/tamponada fosfato solução salina (FBS/PBS), mídia de gradiente de densidade e congelamento médio se cryopreserving células) à temperatura ambiente.
3. Misturar o sangue com um cocktail comercialmente disponível de anticorpos para o enriquecimento de CD4 humano⁺ células T. Use 50 µ l de reagente para cada 1 mL de sangue. Use um tubo de polipropileno cônico de 50 mL para 5 a 15 mL de sangue.
   Nota: Se usar 2 a 4 mL de sangue, execute esta etapa em um tubo de polipropileno cônico 14 mL.
4. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20 min.
5. Dilua a mistura com um volume igual de 2% FBS/PBS
6. Esta mistura diluída em cima da mídia gradiente de densidade lentamente para evitar perturbar a interface e proceder a centrifugação imediatamente para evitar a difusão do sangue no meio de gradiente de densidade da camada.
   1. Para 2 a 3 mL de sangue, usar 3 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo de polipropileno cônico 14 mL, mas para 4 mL de sangue, use 4 mL de meio de gradiente de densidade em um tubo de polipropileno cônico 14 mL e pelo sangue de 5 a 15 mL , use 15 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL.
7. Centrifugar a mistura em camadas por 20 min a 1.200 x g com o freio fora a 20 ° C.
   Nota: Uma temperatura abaixo da temperatura ambiente pode resultar na contaminação com hemácias e granulócitos. Uma velocidade mais baixa fará com que o CD4⁺ processo de isolamento para falhar. Deixar o intervalo de noivos irá diminuir o rendimento da célula. Use uma centrífuga de bancada superior com rotores que podem ser fechados para evitar aerossóis.
8. Remover o CD4 enriquecido⁺ camada de células através da interface usando uma pipeta Pasteur.
   Nota: A camada de células enriquecido será semelhante a um padrão "buffy coat" de células brancas de nublado, mas como só CD4⁺ células estão presentes, naturalmente será menor e mais difícil de ver.
9. Adicionar 2% FBS/PBS para o CD4 células até um volume total de 10 mL e então lave duas vezes com 2% de⁺ FBS/PBS por centrifugação por 10min a 400 x g durante cada lavagem.
10. Resuspenda o pellet em 2% FBS/PBS e contagem das células coradas com um corante vital (azul de trypan) para determinar o número de células e a viabilidade.
11. Passo opcional: Resuspenda 5 x 10⁵ a 1 x 10⁶ células em congelamento médio (10% Dimetilsulfóxido na FBS) em alíquotas de 1 mL.
    Nota: Níveis de alguns marcadores de superfície podem ser alterados por crio-preservação e descongelar. É, portanto, muito importante que todas as amostras são processadas de forma consistente. A fim de minimizar as diferenças nas variáveis analíticas, as amostras foram crio-preservados e em lote para análise neste estudo.

2. fluxo Cytometry

1. Descongelar o CD4 criopreservado⁺ rapidamente as células em um banho de água a 37 ° C e lavagem média de previamente aquecido em uma vez (RPMI 1640 + L-glutamina, suplementado com 10% FBS e 1x penicilina-estreptomicina).
2. Adicionar as células para 9 mL de meio, centrifugar durante 5 min à 400 x g e remover o sobrenadante.
3. Ressuspender as células em 1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS (50 µ l) para que cada uma condição a ser testado usa entre 5 x 10,⁵ e 1 x 10⁶ células.
4. Misture as células com coloração Buffer (50 µ l).
   Nota: Brilhante mancha Buffer impede vários artefactos de coloração que podem interferir com a análise dos dados, quando dois ou mais BV ou compre as manchas são utilizadas simultaneamente devido às propriedades químicas inerentes destes corantes. Em condições simples ou inocente, a 50 µ l de tampão de mancha brilhante pode ser substituído por 50 µ l de 1% BSA/PBS.
5. Adicionar os anticorpos às células (de acordo com o "volume usados" coluna na tabela 1) e incubar no gelo no escuro por 30 min.
6. Lavar as células duas vezes em 1% BSA/PBS por centrifugação por 3 min a 600 x g durante cada lavagem.
7. Resuspenda em 1% BSA/PBS (400 µ l) e transferir para um tubo de aquisição de citometria de fluxo.
8. Vórtice as células suavemente antes de adquirir dados sobre um citômetro de fluxo:

3. set-up e controles de citometria de fluxo

1. Usando um exemplo imaculado, conjunto fotodiodo tensões para que os linfócitos podem ser separados de detritos óbvio e células mortas (eventos com área de dispersão (SSC) lado de alta e baixa dispersão para a frente (FSC))¹⁶. Usando amostras coradas única, defina fotomultiplicador tensões (PMT) para que fluorescência positiva pode ser discernida de fluorescência de fundo enquanto se certificar de que todos os eventos estão dentro da escala detectável.
   Nota: Uma melhoria seria a trama CV contra tensão de PGTO para cada PMT usando grânulos palidamente fluorescentes para encontrar a tensão mínima para resolução ideal (o "Pico 2" método¹⁹).
2. Conta para sobreposição espectral, gerando uma matriz de compensação usando manchas única com grânulos de captura. Adicionar contas de compensação comercialmente disponíveis (60 µ l) e grânulos de controlo negativo (60 µ l) a 1% BSA/PBS (100 µ l) e o vórtice.
   Nota: Os grânulos de captura usados devem coincidir com as espécies de hospedeiros e IgG isotipo do anticorpo sendo usado. A matriz de compensação deve ser re-calculada se o número de lote do qualquer tandem tinge as alterações, como podem exibir considerável variabilidade em seus espectros de emissão entre lotes.
3. Adicione um único anticorpo (20 µ l) e o vórtice.
4. Incube a temperatura ambiente no escuro por 30 min.
5. Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos e descartar o sobrenadante.
6. Resuspenda em 1%BSA/PBS (500 µ l) e vortex.
7. Adquirir a amostra com um citômetro de fluxo, usando o gerador de matriz designado compensação do software de aquisição de acordo com as instruções do fabricante.
8. Use controles de FMO para orientar a colocação de portões para fluorescência de marcador positivo contabilizar derramamento de corante, que é a principal fonte de fluorescência de fundo em experimentos usando ≥4 cores¹⁶. Siga a coloração geral do pilha-superfície de protocolo conforme descrito na etapa 3, mas para cada condição, omitir um do fluorophores da etapa de coloração (onde CD45RA for omitido, também omitir a mancha ao vivo/morto). Adquira 100.000 linfócitos para cada condição.
9. Defina a positividade de portão no ≤ 0.5% das células. Consulte a Figura 2 para obter um exemplo ilustrado de FMO controles.

4. análise de dados

1. Emprega o software de aquisição do citômetro de fluxo para definir um limite de 5.000 unidades no parâmetro FSC para excluir muito pequenos detritos.
2. Usar um portão parar para adquirir 10.000 células cTfh (CD4⁺ CD45RA^– CXCR5⁺).
   Nota: O usuário individual pode recolher mais de 10.000 células. Este número foi um compromisso entre coletando células suficientes para fornecer resultados significativos e ao tempo despendido para a coleção.
3. Usando uma área de FSC / SSC-área ponto enredo, desenhar uma elipse ou polígono portão para selecionar a população de linfócitos, excluindo-se os restos e células abertamente morto (eventos com um SSC-área alta e baixa FSC-área).
4. Usando uma área de FSC / trama do ponto de FSC-largura, desenhar um polígono portão para selecionar células únicas excluindo parelhas (parelhas tem uma área maior mas largura semelhante de células únicas).
5. Usando uma área de FSC / marcador CD45RA e viabilidade ponto enredo, desenhar um portão Retangular para selecionar ao vivo, CD45RA^– (células com uma baixa fluorescência para esse marcador).
6. Usando uma área de FSC / CD4 ponto enredo, desenhar um portão Retangular para selecionar CD4⁺ (células com uma alta fluorescência para esse marcador).
7. Usando um CD4 / CXCR5 ponto enredo, desenhar um portão Retangular para selecionar CXCR5⁺ (i.e., cTfh) (células com uma alta fluorescência para esse marcador).
8. Usando um CXCR3 / trama do ponto de CCR6, lugar um quad portão de subdividir as células cTfh em cTfh1, 2 e 17 células (que são altos e baixos para cada marcador).
   Nota: As células com o fenótipo CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ são mal caracterizada. Chamamos estas células de cTfh1/17¹⁸ porque convencional auxiliar as células T (CD4⁺ CXCR5^–) que estão fazendo a transição entre Th17 e Th1 mostrar expressão de CXCR3 e CCR6 e têm sido descritos como cTfh1/17¹⁹.
9. Usando um histograma de PD-1, use a ferramenta de escala para subdividir as células cTfh (ou se preferirem, o cTfh1 individual, 2, 17 ou 1/17 subconjuntos) em PD-1^{-/ +} ou ^Oi populações.
   Nota: A distinção entre PD-1⁺ e PD-1^Oi não é bem definida na literatura. O limite foi definido como a mesma intensidade de PD-1 necessária para detectar Tfh genuíno em suspensões de linfócitos humanos tonsila usando citometria de fluxo com o mesmo painel de anticorpos. Alternativamente, um marcador para ICOS pode ser adicionado ao painel de anticorpos, como apenas PD1^Oi células são ICOS⁺.

Resultados

CD4 alta⁺ pureza foi conseguida usando o CD4⁺ protocolo de isolamento, que era de confiança em todas as amostras de sangue testadas por nós (quer dizer: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (Figura 3).

Identificação de cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ células) em um assunto normal representativo é apresentado(Figura 4). A proporç...

Discussão

Este protocolo representa uma forma simples e eficiente para analisar as células de cTfh de sangue periférico, permitindo a detecção de todos os subconjuntos relevantes identificados na literatura, até agora. Amostras de sangue podem ser facilmente e eficientemente obtidas como parte do padrão Clínicas ambulatoriais e seriais amostras pode ser coletada em paralelo com os dados clínicos. Por sua vez, isso permite que estudos prospectivos avaliando cTfh subconjuntos como biomarcadores para progressão da doença ou...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973