CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

要約

ここでは、分離と CD4 のキャラクタリゼーションのためのプロトコル⁺ T 細胞サブセットひと末梢血からの説明。CD4 精製⁺ T 細胞は濾胞 T のヘルパー細胞のサブセットの割合を決定するためのフローサイトメトリーで分析しました。

要約

異常 T 濾胞ヘルパー (Tfh) 細胞活性は自己免疫の条件の検出と B 細胞非ホジキン リンパ腫のリンパ節微小環境を分析するとき、彼らの存在は臨床結果と関連付けられました。循環 T 濾胞ヘルパー細胞 (cTfh)、Tfh 細胞、血液中の循環メモリ コンパートメントのサブセットが病気で混乱も、したがって、潜在的な新規予測バイオ マーカーを表します。末梢血でのテストは、比較的非侵襲的な単純なシリアルを監視できますので便利です。CD4 を分離する方法について説明します⁺ T 細胞人間の血液さらに cTfh 細胞としてのさまざまなサブセットの割合を列挙するフローサイトメトリーによる解析から (cTfhPD 1^{-/+ こんにちは}、cTfh1、2、17、cTfh1/17)。これらのサブセットのレベルは、リンパ腫と健常者と患者間比較しました。メソッドが定期的に集められた患者材料から信頼性の高い結果を得るに十分な堅牢なことがわかった。分析について述べる技術は、細胞選別と RT-PCR などダウン ストリーム アプリケーションを簡単に適合できます。

概要

卵胞 T のヘルパー細胞 (Tfh) は、CD4⁺リンパ組織¹で最初に特徴付けられた T 細胞サブセット。これらの細胞は、PD 1 と CXCR5 表面の受容器を表現、イリノイ 21 と IL-4 を分泌し、BCL 6^2,3転写因子の核の式を表示します。その名の通り、彼らは胚中心で発見され、¹高親和性抗体の生産に欠かせない。

調節不全 Tfh の応答は、病気の発症、⁴自己反応性 B 細胞の拡大を促進する最も顕著な自己免疫疾患に関与しています。彼らはまた、固体^5,6のリンパがん⁷腫瘍微小環境における役割を果たします。逆に、表面タンパク質 Tfh の必須の遺伝的欠陥は、ひと免疫不全症候群⁸誘導性 T 細胞 costimulator (アイコス) 結果など機能します。CD4⁺ CXCR5⁺ひと末梢血細胞濾胞 T のヘルパー細胞 (cTfh) と呼ばれている、Tfh 細胞組織⁹のメモリ実装部と考えられています。ここで説明したメソッドの目的は次の CD4 cTfh サブセットの解析⁺細胞の末梢血から分離。

いくつかの cTfh のサブセットが定義され、彼らが B 細胞の助けを提供効率は異なります 1 つのサブセット別^9,10、11,12。これらのサブセットの相対的な割合は、そこでほとんどの目立つように自己免疫疾患がより機能的な PD 1 の相対的な増加ではほとんど常に、病気の数で変更されます^{+ こんにちは}以下と比較して cTfh2 または cTfh17 のサブセットおよび/または機能的な PD-1^-および cTfh1 サブセット¹²。これらの変更の程度は頻繁 cTfh サブセット分布の Tfh のアクティビティを反映可能性があります病気の予後バイオ マーカーとしての潜在的な役割を示す、疾患活動と自己抗体の抗体価を含む臨床パラメーターに関連付けるリンパ組織^9,12,13,14。また、参加者からの血液採取は迅速、安全かつ許容できのでシリアル病気の進行や治療への反応の分析のための監視します。

孤立した CD4 の使用伝統的な末梢血単核細胞 (マーカー) 懸濁液上⁺ T 細胞 cTfh 細胞解析のための相当な数を取得する必要な時間を減らすことによってより高いスループット流れ cytometry 実験を有効にします。これは、セル (FACS) を並べ替え並べ替えの流れを使用して珍しい cTfh サブセットからセルをアクティブになったときに特に便利です。効率化を支援するために""流れの cytometry の実験で使用されるサンプルのバッチ処理を有効にするこれらの懸濁液を凍結保存することができます。テスト、CD4 の⁺純度は凍結によって減少されていません。

シュミットら^12,によって提案されている細胞表面マーカーの 2 つのグループの統一された方式を使用して彼らの発見方法の初期の段階で cTfh 細胞を分類する使用される別の所の別のマーカーはここで紹介中¹⁵ cTfh と単一フローサイトメトリーでその 9 認識されたサブセットの同時識別を有効にするのに実験します。

唯一セル表面のマーカーを使用すると、セル固定や透過、不要、したがって下流の機能研究のため生きている残ることができます。FACS を用いた同じ抗体パネルを並べ替え] セルで、これを促進する可能性があります。このパネルは、使用されている流れの cytometer の制限を可能にする他のマーカーを含むように拡張可能性があります。

マルチカラー フロー フローサイトメトリー実験の分析は特に細胞集団が蛍光マーカーとしての明確なバイモーダル分布を持っていない場合, 2次元ドット プロットにゲーティングの本質的に主観的な性質のために挑戦することができます、cTfh 細胞およびそのサブセット用ケース。このため、人口のより良い解決を有効にして自信を持って戦略をゲートを設定する工芸品を減らすために効果的なコントロールを設定することが不可欠です。抗体パネル デザインとフローサイトメトリー用の基本的なコントロールのセットアップ実験、すなわち、補正し FMO コントロールのステップ 3.4.2 および 3.4.3,respectively のとおり。

CTfh のすべてのセルが CD4 として定義されている⁺ CXCR5⁺ CD45RA^-。特性の Tfh 活性化マーカー PD 1 の表現のレベルは、PD 1^-、PD 1⁺または PD 1^{こんにちは}cTfh セルのサブセットを識別するために決定できます。その後、CCR6 と CXCR3 ケモカイン受容体の組み合わせを使用して、伝統的な Th1、2 または 17 細胞、cTfh によって発現するとして特徴付けられる cTfh1、2 または CXCR3 のプロフィールによって 17 のような⁺ CCR6^-、CXCR3^- CCR6^-と CXCR3^- CCR6⁺、それぞれ。

私たちの研究室で使用される抗体パネルは、表 1に表示されます。ユーザーは、彼らのローカル流れの cytometer 上使用可能なレーザーと光フィルター構成を考慮して、fluorophore 選択を適応させる必要があります。

次の考慮事項 fluorophores の選択に影響します。できるだけ明るい蛍光物質を使用します。特に、明度 (それほど高い表現) マーカーの最も明るい利用できる蛍光物質を使用します。PD 1、CXCR3 CCR6 などの調光器のマーカーとより少ない程度に、CXCR5。具体的には新しい BB、BV、BUV 使用してフルオロ優れた輝度を提供し、こうして細胞の異なる集団の簡単に解像度を有効にします。

発光スペクトルの重複そしてこうして必要な補償のレベルを最小限に抑えるため可能な限り分散 fluorophore 選択。流れ cytometry パネルの設計を支援するために使用することができます無料、フリー、オンライン ツールをここで見つけることができます: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer。発光スペクトルの領域を節約する両方の死者の検出 (および除外) 有効にする APC h7 (CD45RA に共役) と重なる部分発光波長性色素を用いた「ダンプ チャンネル」を採用または CD45RA⁺を使用して、単一の検出器。

ここでは、異なると最近記述されているサブセットを循環の割合を決定するためのフローサイトメトリーによる末梢血 CD4⁺ T 細胞の分離とその後の分析のためのプロトコルが表示されます。

プロトコル

血液サンプルは健常者 (NS) から得られた (n = 12) 辺縁帯リンパ腫 (MZL) 患者だけでなく、(n = 7) および他の種類の B 細胞非ホジキン リンパ腫 (BNHL) (6 FL 患者、2, リンパ形質細胞性リンパ腫患者および 1 の低悪性度 B 細胞非ホジキン リンパ腫明記のない患者)。患者は情報を与えて、すべての研究のための場所で倫理的な承認を得て、書面による同意後レスターのロイヤル診療所で血液診療所から募集されました。倫理的な承認は、レスターシャー、ノーサンプトンシャー、ラトランド研究倫理委員会 1、患者のサンプルと健康研究機関 (HRA) システムオン委員会イースト ・ ミッドランズ-ダービーの 06/Q2501/122 参照によって得られた、14/EM/1176 を参照健常者。

1. CD4 の分離⁺全末梢血 T 細胞

1. K₂EDTA 管に標準的な穿刺および最大実行可能性を維持するために、できるだけ早く処理による新鮮な末梢血 (2 に 15 mL) を取る。
   注:規格研究所個人保護具 (コート、手袋、メガネ) を使用し、クラス II の安全キャビネットで仕事を遂行します。
2. 血とすべての必要な試薬をもたらす (CD4⁺トウキョウ セル場合凍結媒体密度勾配メディア、2% 胎仔ウシ血清/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS/FBS) 濃縮カクテル) 室温に。
3. 血を混ぜて人間 CD4 の濃縮のための抗体の市販カクテル⁺ T 細胞。血のすべて 1 mL に試薬 50 μ L を使用します。血の 5 に 15 mL の 50 mL のコニカル ポリプロピレン チューブを使用します。
   注:4 に 2 ミリリットルの血液を使用している場合は、この手順を実行 14 mL の円錐ポリプロピレン管で。
4. 20 分間室温で混合物を孵化させなさい。
5. 2% の等量混合物を希釈 FBS/PBS
6. 密度勾配メディア インターフェイスを妨害しないし、密度勾配媒体への血液の拡散を避けるためにすぐに遠心分離に進みますをゆっくりと上にこの希釈混合気を層します。
   1. 2 に 3 ml の血、14 mL の円錐のポリプロピレン管ですが 4 mL の血液の密度勾配媒体 3 mL を使用してください、14 mL の円錐形ポリプロピレン管および 5 に 15 mL の血液の密度勾配媒体 4 mL を使用してください、50 mL コニカル ポリプロピレン チューブの密度勾配媒体 15 mL を使用しています。
7. 20 ° C でブレーキをオフ 1,200 x gで 20 分間の層の混合物を遠心します。
   注:以下周囲温度は赤血球および顆粒球による汚染にあります。低速は、CD4 を原因となります⁺分離プロセスが失敗します。従事して休憩を残して細胞収量が低下します。エアロゾルを防ぐために閉じることができるローターを備えたベンチ トップ遠心分離機を使用します。
8. 濃縮の CD4 を削除⁺パスツール ピペットを使用してインターフェイスから細胞層。
   注:濃縮細胞層の標準「バフィー コート」cd4 陽性だけではなく白い曇りの細胞のようになります⁺細胞が存在、これは当然のことながら小さいと見づらい。
9. 追加 2 %fbs/PBS CD4 に⁺細胞量 10 mL、2% で 2 回洗いまで FBS/PBS 各洗浄中に 400 x gで 10 分間遠心分離。
10. 2% でペレットを再懸濁します細胞染色細胞数と生存率を決定する重要な染料 (トリパン ブルー) FBS/PBS とカウント。
11. オプションのステップ: 5 x 10⁵ 1 ml 中 (FBS の 10% ジメチルスルホキシド) を凍結で 1 x 10 の⁶セルを再懸濁します。
    注:低温保存と融解によっていくつかの表面のマーカーのレベルを改変すること。それは、したがって、非常に重要なすべてのサンプルが一貫して処理されます。分析変数の違いを最小限にするためサンプルは低温保存と本研究における解析のバッチだった。

2. フローサイトメトリー

1. 融解凍結 CD4⁺細胞 37 ° C、洗って一度に予め温めておいた媒体 (RPMI 1640 + L-グルタミン 10 %fbs と 1 x ペニシリン-ストレプトマイシン補完) で水バースの迅速に。
2. 9 mL 400 × gで 5 分間遠心分離媒体にセルを追加し、上清を除去します。
3. PBS で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で細胞を再懸濁します (50 μ L) をそれぞれの条件をテストするのには、5 x 10 の⁵と 1 x 10 の⁶セルの使用します。
4. セルを混ぜて染色バッファー (50 μ L)。
   メモ: 華麗な染色バッファーは、これらの染料の固有の化学的性質により同時に使用する 2 つ以上の BV または BUV 汚れデータ分析を妨げる様々 な染色工芸品をできなくなります。鮮やかな染色バッファーの 50 μ L を 1% の 50 μ L に置き換えることが、単一または無染色条件で BSA/PBS。
5. (あたりで表 1する「使用量」の列) のセルに抗体を追加し氷上で 30 分間暗闇の中で孵化させなさい。
6. 1% の 2 回セルを洗浄 BSA/PBS 各洗浄中に 600 x gで 3 分間遠心分離。
7. 1% で再懸濁します BSA/PBS (400 μ L) と流れ cytometry 取得管への転送。
8. 渦流れの cytometer でデータを取得する前に優しく細胞。

3. 流れの Cytometry コントロールとセットアップ

1. 明白な破片や死んだ細胞 (ハイサイド (SSC) の散布面積と低前方散乱 (FSC) エリア イベント)¹⁶からリンパ球を分離できるようにフォト ダイオード電圧を設定無染色のサンプルを使用します。単一のステンド グラス サンプルを使用すると、光電子増倍管 (PMT) 電圧ように設定すべてのイベントが検出可能な規模の内で落ちると確信して作っている間バック グラウンド蛍光から蛍光陽性が分かるでしょう。
   注:改善すると、PMT 電圧に対して最適な解像度 (「ピーク 2」法¹⁹) の最低電圧を見つけるにぼんやりと蛍光ビーズを用いた各 PMT の CV をプロットします。
2. キャプチャ ビーズと単一の汚れを使用して補償行列を生成することによりスペクトル重複アカウント。市販補償ビーズ (60 μ L) とネガティブ コントロール ビーズ (60 μ L) を 1% に追加 BSA/PBS (100 μ L) と渦。
   注:使用するキャプチャ ビーズは、宿主および使用されている抗体の IgG アイソタイプを一致しなければなりません。補償行列必要があります再計算場合は、タンデムのロット番号染料変更、ロット間の発光スペクトルにおけるかなりの変動を表示できます。
3. 単一の抗体 (20 μ L) と渦を追加します。
4. 暗闇のなかで 30 分室温で孵化させなさい。
5. 200 x gで 10 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
6. 1%BSA/PBS で再懸濁します (500 μ L) と渦。
7. 製造元の指示に従って取得ソフトウェアで指定された補償行列ジェネレーターを使用して流れの cytometer でサンプルを取得します。
8. FMO コントロールを使用して、≥4 色¹⁶の実験で背景の蛍光性の主要なソースである、染料の流出を考慮しての陽性マーカー蛍光のゲートの配置をご案内します。条件ごとに、ステップ 3 で説明一般的な細胞表面染色プロトコルに従って省略1 つの染色手順からフルオロ (CD45RA は省略すると、ただしライブ/死者の汚れは省略も)。条件ごとに 100,000 のリンパ球を取得します。
9. セルの ≤0.5% でゲート陽性を設定します。FMO コントロールの図解例については図 2を参照してください。

4. データ解析

1. 非常に小さな破片を除外する FSC パラメーターに 5,000 台のしきい値を設定する流れの cytometer の集録ソフトウェアを採用してください。
2. 停止ゲートを使用して 10,000 の cTfh セルを取得 (CD4⁺ CD45RA^- CXCR5⁺)。
   注:個々 のユーザーは、以上 10,000 のセルを収集できます。この数は、意味のある結果と回収時間を提供するために十分なセルの収集間の妥協だった。
3. FSC 領域を使用して/SSC 地域ドット プロット描画しながら破片を除くリンパ球の人口を選択する楕円や多角形ゲートとあからさま死んで細胞 (高い SSC 地域と低 FSC エリア イベント)。
4. FSC 領域を使用して/FSC 幅ドット プロット、ポリゴンは描画ゲート (ダブレットがある単一のセルに同じような幅が拡大された領域) のダブレットを排除しながら単一のセルを選択します。
5. FSC 領域を使用して CD45RA と生存率マーカー ドット プロット/ライブ、CD45RA を選択長方形のゲートを描く^-細胞 (このマーカーの低蛍光細胞)。
6. FSC 領域を使用して/CD4 ドット プロット、CD4 を選択長方形のゲートを描く⁺のセル (このマーカーの高い蛍光セル)。
7. CD4 を使用して CXCR5 ドット プロット/CXCR5 を選択長方形のゲートを描く (このマーカーの高い蛍光細胞) 細胞の⁺ (すなわち、cTfh)。
8. 使用して、CXCR3/CCR6 ドット プロット、クワッドはゲートに cTfh1、cTfh セルを分割する 2 と 17 細胞 (高低各マーカーは、細胞)。
   注:⁺ CXCR5 CD4 表現型と細胞⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺は悪いが特徴します。我々 は cTfh1/17¹⁸としてこれらのセルを参照従来ヘルパー T 細胞 (CD4⁺ CXCR5^-) CXCR3 の th17 細胞と th1 細胞の表示式と CCR6 の間の移行は、cTfh1/17¹⁹として記載されています。
9. 範囲ツールを使用して cTfh セルを分割 PD 1 ヒストグラムを使用して (または、個々 の cTfh1 2、17 または 1/17 のサブセットが好ましい場合) PD 1 に^-/+または^{こんにちは}個体群。
   注:PD 1⁺と PD 1^{こんにちは}間の区別は文献で定義されています。しきい値は、同じ抗体パネルとフローサイトメトリーを用いたヒト扁桃リンパ球懸濁液の正真正銘の Tfh を検出するために必要な同じ PD 1 強度として設定されました。また、PD1^{こんにちは}セルだけはアイコス⁺、ICOS のマーカーを抗体パネルに追加できます。

結果

高い CD4⁺純度は、CD4 を使用して達成された⁺隔離のプロトコルは、すべての血液サンプルの間で信頼性があったが私たちによってテスト (意味: 96.6%、SD: 2.38、n = 31) (図 3)。

CTfh の同定 (CD4⁺ CXCR5⁺細胞) 代表的な健常者では提案する (図 4A...

ディスカッション

このプロトコルでは、これまで文献で識別されるすべての関連するサブセットの検出の有効化、末梢血 cTfh 細胞を分析するシンプルかつ効率的な方法を表します。標準的な外来患者診療所やシリアルのサンプルの一部は、臨床データと並行して集めることができるよう、血液サンプルを簡単に効率的に入手できます。ターンでは、これにより病気の進行や治療への反応のバイオ マーカーとし...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973