Изоляция CD4+ Т-клеток и анализ циркулирующих Т-фолликулярная помощник (cTfh) клеток подмножеств из периферической крови с помощью 6-цвет потока цитометрии

Резюме

Здесь, протокол для изоляции и характеристика CD4⁺ Т-клеток описал подмножеств из периферической крови человека. Очищенный CD4⁺ Т-клетки анализируются проточной цитометрии для определения пропорции T-фолликулярных клеток помощник подмножеств.

Аннотация

Ненормальная T-фолликулярная активность клеток помощник (ЦГЗ) обнаружен в аутоиммунных условий, и их присутствие ассоциируется с клинических исходов при анализе микроокружения лимфоузлов в B-клеточной неходжкинской лимфомы. Подмножества циркулирующих Т-фолликулярных клеток помощник (cTfh), циркулирующей отсека памяти Tfh клеток в крови, также возмущенных в болезни и поэтому представляют собой потенциальный Роман интеллектуального биомаркеров. Периферической крови ориентированное тестирование выгодно, потому что это относительно неинвазивные и позволяет простой последовательный мониторинг. Эта статья описывает метод для изоляции CD4⁺ Т-клетки из крови человека и дальнейшего анализа подачей cytometry перечислить cTfh клеток и пропорции их различных подмножеств (cTfhPD-1^{-/ +/ Привет}, cTfh1, 2, 17 и cTfh1/17). Уровень этих подмножеств был затем сравнить между обычные предметы и пациентов с лимфомой. Мы обнаружили, что метод был достаточно прочным, чтобы получить надежные результаты регулярно собранного материала пациента. Техника, которую мы опишем для анализа может быть легко адаптирована для сортировки клеток и нисходящие приложения, такие как RT-PCR.

Введение

T-фолликулярная хелперы (ЦГЗ) являются CD4 Т-клеток подмножества, который первоначально был охарактеризован в лимфоидной ткани¹⁺ . Эти клетки выразить PD-1 и CXCR5 поверхностная рецепторов, секретируют Ил-21 и Ил-4 и показать выражение ядерного транскрипционного фактора, BCL-6^2,3. Как их названия, они находятся в зародышевых центров и необходимы для высокое сродство антитела производства¹.

Dysregulated Tfh ответы были вовлечены в патогенез заболевания, прежде всего аутоиммунных заболеваний, где они способствуют расширению клетки аутореактивная B⁴. Они также играют роль в микроокружения опухоли твердых^5,6 и⁷лимфоидной опухоли. И наоборот генетические дефекты поверхности белков, необходимых для Tfh функционировать как индуцибельной Т-клеточной costimulator (МСОН) результат в синдромы иммунодефицита человека⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ клеток в периферической крови человека называются циркулирующих Т-фолликулярных клеток помощник (cTfh) и считается отсек памяти Tfh клеток в тканях⁹. Цель метода, описанного здесь является анализ cTfh подмножеств после CD4⁺ ячейки изоляции от периферической крови.

Были определены несколько подмножеств cTfh и эффективность, с которой они помогают B-клетка отличается от одной подмножество другой^9,10,,1112. Относительные пропорции этих подмножеств изменяются в ряде заболеваний, наиболее заметно аутоиммунное заболевание в котором есть почти всегда является относительное увеличение более функциональных PD-1^{+/ Привет} или cTfh2 или cTfh17 подмножества по сравнению с менее функциональные PD-1^– или cTfh1 подмножеств¹². Масштабы этих изменений часто связать с клинические параметры, включая болезнь активности и аутоантител титры, указывающее потенциальную роль cTfh подмножество распределения как прогностического биомаркера в болезнь, которая может отражать деятельность ЦГЗ в лимфоидной ткани^9,12,,1314. Кроме того проб крови от участников является быстрым, безопасным и приемлемым и поэтому позволяет последовательный мониторинг для анализа прогрессирования заболевания или ответа на терапию.

Использование изолированных CD4⁺ Т-клетки над традиционными периферической крови одноядерных клеток (PBMNC) подвески позволяет выше пропускная способность потока цитометрии эксперименты путем сокращения времени, необходимого для приобрести значительное количество клеток cTfh для анализа. Это особенно полезно, когда сортировка клеток из редких cTfh подмножества потока с помощью активации клеток, сортируя (FACS). Чтобы помочь эффективности, эти подвески можно криоконсервированных для включения «Пакетная обработка» образцов для использования в эксперименте цитометрии потока. На тестирование, CD4⁺ чистоты не было уменьшено криоконсервирования.

Хотя здесь представлены различные лаборатории используются различные маркеры классифицировать cTfh клеток на ранних стадиях их открытия, метод делает использование единой схемы двух групп клетк поверхности маркеров, предложенный Шмидт et al.^{12, 15} для одновременной идентификации cTfh и их девяти признанных подмножества в одном проточной цитометрии эксперимент.

Как используются только маркеры поверхности клетки, клетки не требуют фиксации или permeabilization и таким образом могут оставаться живыми течению функциональных исследований. Это могло бы способствовать путем сортировки с помощью СУИМ с той же панелью антитела клетки. Эта группа может быть расширена для включения других маркеров, позволяя для ограничения потока цитометр используется.

Анализ потока многоцветные цитометрии экспериментов может быть сложным из-за по существу субъективный характер стробирования на 2-мерной точки участках, особенно когда клеточных популяций не имеют четкой Би Модал распределения в маркер флуоресценции, как это чехол для cTfh клеток и их подмножества. По этой причине важно создать эффективные механизмы контроля для уменьшения артефактов лучше разрешение населения и установить стробирования стратегии уверенно. Таким образом дизайн панели антитела и настройке основных элементов для проточной цитометрии эксперимента, то есть, используя компенсации и FMO контроля изложены в шаге 3.4.2 и 3.4.3,respectively.

Все cTfh клетки определяются как CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. Уровень выражения характерным Tfh маркера активации PD-1 затем может быть определен для определения подмножества PD-1^-, PD-1⁺ или PD-1^Привет cTfh клетки. Затем, используя комбинацию хемокиновых рецепторов, CXCR3 и CCR6, которые дифференцировано выраженные традиционных Th1, 2 или 17 клетки, cTfh можно охарактеризовать как cTfh1, 2-17-как по профилю CXCR3⁺ CCR6^-, CXCR3^– CCR6^- и CXCR3^– CCR6⁺, соответственно.

В таблице 1отображается панель антитела, используемые в нашей лаборатории. Пользователю может потребоваться адаптировать их Флюорофор выбор для учета для лазерных и светофильтр конфигурации доступны на их местных проточный цитометр.

Следующие факторы влияют на выбор флуорофоров. Используйте яркие флуорофоров, там, где это возможно. В частности используйте ярких доступных флуорофоров на тёмной (менее сильно выраженной) маркеры. Диммер маркеры включают PD-1, CXCR3 и CCR6 и в меньшей степени, CXCR5. Мы специально сделали использование новых BB, БВ и був флуорофоров, которые обеспечивают отличную яркость и таким образом позволяют проще резолюции различных популяций клеток.

Распространение Флюорофор выбор через спектры выбросов, насколько это возможно свести к минимуму спектрального наложения и, таким образом, уровень компенсации требуется. Бесплатно, онлайн инструмент, который может использоваться для оказания помощи в проектировании группа цитометрии потока можно найти здесь: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Для экономии места на спектр излучения, мы заняты каналом «дампа» с помощью жизнеспособности краска с длина волны излучения, которая перекрывается с что APC-H7 (конъюгированных с CD45RA) для включения обнаружения (и исключения) оба умерли или CD45RA⁺ с помощью один детектор.

Здесь протокол для изоляции периферической крови CD4⁺ Т-клеток и их последующего анализа представлена проточной цитометрии для определения пропорции различных и недавно описал, циркулирующих подмножеств.

протокол

Образцы крови были получены от обычных предметов (НС) (n = 12) а также пациентов с лимфомой маргинальные зоны (MZL) (n = 7) и других типов B-клеточной неходжкинской лимфомы (BNHL) (6 FL больных, 2 Лимфоплазмоцитарной лимфомы пациента и 1 низкосортных B-клетки Неходжкинской лимфомы не оговорено пациента). Пациенты были набраны из Гематология клиники на Лестер Королевской больнице после того, как дали информацию, письменного согласия, этические утверждения в место для всех исследований. Этическое одобрение было получено Лестершир, Нортгемптоншир и Ратленд исследовательской этики Комитета 1, 06/Q2501/122 ведения пациентов образцов и центр исследований работоспособности (HRA) NRES Комитет Восточный Мидландс-Дерби, ссылка 14/EM/1176 для обычные предметы.

1. изоляция CD4⁺ T-клетки от всей периферической крови

1. Учитывать свежие периферической крови (2-15 мл)₂K ЭДТА трубы стандартные венепункции и процесс как можно скорее для поддержания максимальной жизнеспособности.
   Примечание: Используйте стандартные лабораторные средства индивидуальной защиты (пальто, перчатки, очки) и выполнять работу в классе II биобезопасности кабинет.
2. Кровь и все необходимые реагенты (CD4⁺ обогащения коктейль, 2% плода bovine сыворотки/фосфатный буфер (FBS/PBS), градиент плотности СМИ и замораживание среднего, если cryopreserving клетки) до комнатной температуры.
3. Смешайте кровь с коммерчески доступных коктейль антител для обогащения человеческого CD4 клеток T⁺ . Используйте 50 мкл реагента для каждого 1 мл крови. Используйте 50 мл конические полипропиленовые трубы для 5-15 мл крови.
   Примечание: Если с помощью 2-4 мл крови, выполните этот шаг в 14 мл конические полипропиленовые трубы.
4. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Разбавьте смесь с равным объемом 2% FBS/PBS
6. Слой этот разреженных смесь на вершине СМИ градиента плотности медленно, чтобы не мешать интерфейс и приступить к центрифугирования немедленно, чтобы избежать распространения крови в средний градиент плотности.
   1. Для 2-3 мл крови 3 мл раствора градиент плотности среды в 14 мл конические полипропиленовые трубы, но для 4 мл крови, используйте 4 мл средний градиент плотности в 14 мл конические полипропиленовых труб и для 5-15 мл крови , используйте 15 мл средний градиент плотности в 50 мл конические полипропиленовые трубы.
7. Центрифуга слоистых смесь для 20 минут 1200 x g с тормозом с при 20 ° C.
   Примечание: Температуре ниже атмосферного может привести к загрязнению с красных кровяных клеток и гранулоциты. Более низкой скорости приведет к CD4⁺ к сбою процесса изоляции. Оставляя перерыва открыли будет уменьшаться клеток урожайности. Используйте скамейке Топ центрифуги с роторами, которые могут быть закрыты для избежания аэрозолей.
8. Удаление обогащенного CD4⁺ слоя клеток из интерфейса с помощью пипетки Пастера.
   Примечание: Слой обогащенного клетки будет напоминать стандарт «Баффи Пальто» белый облачный клеток, но как только CD4⁺ клетки присутствуют, естественно, это будет меньше и более трудно увидеть.
9. Добавить 2% FBS/PBS на CD4 клеток⁺ до общего объема 10 мл и затем дважды промыть 2% FBS/PBS центрифугированием 10 мин на 400 x g при каждой стирке.
10. Ресуспензируйте гранулы в 2% FBS/PBS и count клетки окрашивали жизненно краситель (Трипановый синий) для определения числа клеток и жизнеспособности.
11. Необязательный шаг: Ресуспензируйте 5 x 10⁵ до 1 x 10⁶ клеток в замораживания среднего (10% диметилсульфоксида в FBS) в 1 мл аликвоты.
    Примечание: Уровни некоторых поверхностных маркеров могут быть изменены на крио сохранение и оттаивания. Это, таким образом, очень важно, что все образцы обрабатываются последовательно. Для того, чтобы свести к минимуму различия в аналитических переменных, образцы были крио сохранились и пакетном режиме для анализа в настоящем исследовании.

2. проточной цитометрии

1. Оттепель криоконсервированных CD4⁺ клетки быстро в водяной бане при 37 ° C и мыть раз в подогретым среднего (RPMI 1640 + L-глютамином 10% FBS и 1 x пенициллин стрептомицином).
2. Добавление ячеек в 9 мл среды, центрифуги для 5 мин на 400 x g и удалить супернатант.
3. Ресуспензируйте клеток в 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS (50 мкл) так, что каждое условие проверяется использует между 5 x 10⁵ и 1 х 10⁶ клеток.
4. Смешать клетки с пятнать буфера (50 мкл).
   Примечание: Блестящие пятна буфера предотвращает различные окрашивание артефакты, которые могут помешать с анализом данных, когда два или более BV или був пятна используются одновременно ввиду присущего химических свойств этих красителей. В условиях единого или безупречный, 50 мкл буфера блестящее пятно может быть заменен на 50 мкл 1% BSA/PBS.
5. Добавьте антитела клетки (в соответствии с «тома» столбец в таблице 1) и инкубировать на льду в темноте за 30 мин.
6. Вымыть клетки дважды в 1% BSA/PBS центрифугированием на 3 мин на 600 x g при каждой стирке.
7. Ресуспензируйте в 1% BSA/PBS (400 мкл) и передачи в поток цитометрии приобретение трубку.
8. Вихревой клетки мягко до приобретения данных на проточный цитометр:

3. течь цитометрии элементов управления и настройки

1. Используя пример безупречная, установите напряжение фотодиода, так что лимфоциты могут быть отделены от очевидный мусор и мертвые клетки (события с высокой стороне точечной (SSC) площадью и низкой вперед точечной (FSC))¹⁶. С помощью единого окрашенных образцов, установите фотоэлектронный умножитель напряжения (ПЛТ), так что позитивные флуоресцирования можно проследить от фона флуоресценции при убедившись, что все события подпадают обнаружению масштаба.
   Примечание: Улучшение бы участок CV против ПЛТ напряжения для каждого ПЛТ, используя тускло флуоресцентные бусины найти минимальное напряжение для оптимального разрешения («Пик 2» метод¹⁹).
2. Учетная запись для спектральных дублирования путем создания матрицы компенсации с использованием одного пятна с бисером захвата. Добавить к 1% коммерчески доступных компенсации бусины (60 мкл) и отрицательный контроль бусины (60 мкл) BSA/PBS (100 мкл) и вихрь.
   Примечание: Захват бисер используется должны совпадать с принимающей видов и IgG изотипа антитела используются. Матрица компенсации должно быть пересчитаны если номер лота любого тандем красители изменения, как они могут отображать значительные различия в их спектры выбросов между партиями.
3. Добавление одного антитела (20 мкл) и вихря.
4. Инкубируйте в темноте за 30 мин при комнатной температуре.
5. Центрифуга на 200 x g 10 мин и удалить супернатант.
6. Ресуспензируйте в 1%BSA/PBS (500 мкл) и вихря.
7. Получить образец с проточный цитометр, используя генератор матрица назначенный компенсации в приобретение программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя.
8. Используйте элементы управления FMO для указания размещения ворот для флуоресценции положительных маркер для учета разлива краситель, который является главным источником фон флуоресценции в экспериментах с использованием ≥4 цвета¹⁶. Следуйте общие пятнать поверхности клетки протокол, как описано в шаге 3, но для каждого условия, пропустить один из флуорофоров от этапа окрашивания (где CD45RA опущен, также опустить жить/мертвые пятна). Приобрести 100 000 лимфоцитов для каждого условия.
9. Установите ворота положительность на норме % клеток. Смотрите Рисунок 2 пример иллюстрируется FMO элементов управления.

4. анализ данных

1. Использовать проточный цитометр приобретение программного обеспечения для установки порога 5000 единиц на параметре FSC для исключения очень мелких частиц мусора.
2. Используйте остановки ворот для приобретения 10000 cTfh клетки (CD4⁺ CD45RA^– CXCR5⁺).
   Примечание: Индивидуальный пользователь может собирать более чем 10 000 ячеек. Это число представляет собой компромисс между сбор достаточно клеток для получения значимых результатов и времени для коллекции.
3. С использованием FSC-область / SSC-области точка сюжет, нарисуйте эллипс или многоугольник ворота для выбора населения лимфоцитов, пока за исключением мусора и открыто мертвые клетки (события с высоким SSC-площадью и низкой FSC-).
4. С использованием FSC-область / FSC-ширина точка сюжет, ничья в полигон ворота выбрать отдельные ячейки исключая Дуплеты (Дуплеты имеют расширение области, но аналогичные ширина в отдельные ячейки).
5. С использованием FSC-площадь CD45RA и жизнеспособности маркера точки участка, Нарисуйте прямоугольный ворота для выбора жить, CD45RA^– (клетки с низкой флуоресценции для этого маркера).
6. С использованием FSC-область / CD4 точка сюжет, Нарисуйте прямоугольный ворота для выбора CD4⁺ клетки (клетки с высоким флуоресценции для этого маркера).
7. С помощью CD4 / CXCR5 точка сюжет, Нарисуйте прямоугольный ворота для выбора CXCR5⁺ (т.е. cTfh) клетки (клетки с высоким флуоресценции для этого маркера).
8. С помощью CXCR3 / CCR6 точка сюжет, место quad ворота для разделения клетки cTfh на cTfh1, 2 и 17 клетки (клетки, которые являются высокими и низкими для каждого маркера).
   Примечание: Клетки с фенотипом CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ являются плохо характеризуется. Мы называем эти клетки cTfh1/17¹⁸ потому что обычных вспомогательные Т-лимфоцитов (CD4⁺ CXCR5^–), переход между Th17 и Th1 шоу выражение CXCR3 и CCR6 и были описаны как cTfh1/17¹⁹.
9. С помощью гистограммы PD-1, используйте средство диапазон для разделения клетки cTfh (или по желанию, отдельные cTfh1, 2, 17 или 1/17 подмножеств) в PD-1^{-/ +} или ^Привет населения.
   Примечание: Различие между PD-1⁺ и PD-1^Привет не четко определены в литературе. Порог был установлен как той же интенсивности PD-1, необходимых для выявления Tfh Бона ФИДЕ в суспензиях лимфоцитов человека миндалин, с помощью проточной цитометрии с той же панелью антитела. Кроме того маркера для ICOS могут быть добавлены к панели антитела, только PD1^Привет клетки находятся ICOS⁺.

Результаты

Высоким CD4⁺ чистоты была достигнута с помощью CD4⁺ Протокол изоляции, который был надежным во всех образцов крови проверена нами (означает: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (рис. 3).

Выявление cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ клетки) в предста?...

Обсуждение

Этот протокол представляет собой простой и эффективный способ для анализа клеток периферической крови cTfh, Включение обнаружения всех соответствующих подмножеств, идентифицированных в литературе. Можно легко и эффективно получить образцы крови, как часть стандартных амбулаторных кл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973