Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Résumé

Ici, un protocole pour l’isolement et la caractérisation des CD4⁺ T-cellule sous-ensembles de sang périphérique humain est décrite. Purifiée CD4⁺ T-cellules sont analysés par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des sous-ensembles de cellule auxiliaire T-folliculaire.

Résumé

Aberrante activité folliculaire T des cellules d’assistance (Tfh) est détectable dans les maladies auto-immunes et leur présence est associée à des résultats cliniques lorsque le microenvironnement de ganglion lymphatique en cellules B lymphome non hodgkinien-est analysé. Sous-ensembles de circulation les cellules folliculaires-T helper (cTfh), le compartiment mémoire circulant de Tfh cellules dans le sang, sont également perturbées dans la maladie et représentent donc les potentiels nouveaux biomarqueurs prédictifs. Test basé sur sang périphérique est avantageuse car elle est relativement non invasive et permet la surveillance série simple. Cet article décrit une méthode pour isoler les CD4⁺ T-cellules de sang humain et une analyse plus approfondie par cytométrie en flux-énumérer les cellules cTfh et les proportions de leurs divers sous-ensembles (cTfhPD-1^{-/ + / hi}, cTfh1, 2, 17 et cTfh1/17). Le niveau de ces sous-ensembles a ensuite été comparé entre les sujets normaux et de patients atteints de lymphome. Nous avons trouvé que la méthode était assez robuste pour obtenir des résultats fiables de matériel patient systématiquement recueilli. La technique nous décrivons pour l’analyse peut être facilement adaptée à la cellule de tri et d’applications en aval comme la RT-PCR.

Introduction

T-folliculaires cellules auxiliaires (Tfh) sont un CD4⁺ sous-ensemble de cellules T qui était initialement définie dans les tissus lymphoïdes¹. Ces cellules expriment PD-1 et des récepteurs de surface CXCR5, sécrètent IL-21 et IL-4 et show nucléaire expression de BCL-6^2,3, le facteur de transcription. Comme leur nom l’indique, ils sont trouvent dans les centres germinatifs et sont essentielles pour haute affinité anticorps production¹.

Les réponses de Dysregulated Tfh ont été impliqués dans la pathogenèse de la maladie, notamment une maladie auto-immune, où ils favorisent l’expansion des cellules de lymphocytes B⁴. Ils jouent également un rôle dans le microenvironnement tumoral de solide^5,6 et cancers lymphoïdes⁷. À l’inverse, des anomalies génétiques, des protéines de surface indispensables pour Tfh fonctionnent comme résultat de costimulator (ICOS) T-cell inductible de syndromes d’immunodéficience humaine⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ cellules dans le sang périphérique humain sont appelés lymphocytes auxiliaires T-folliculaire (cTfh) en circulation et sont censées être le compartiment de la mémoire des cellules Tfh en tissus⁹. Le but de la méthode décrite ici est l’analyse des sous-ensembles de cTfh suite CD4⁺ cellule d’isolement à partir d’échantillons de sang périphérique.

Plusieurs sous-ensembles cTfh ont été définis et l’efficacité avec laquelle ils fournissent aide de B-cellule diffère d’un sous-ensemble à un autre^9,10,11,12. Les proportions relatives de ces sous-ensembles sont modifiées dans un certain nombre de maladies, la plupart en évidence une maladie auto-immune dans laquelle il est presque toujours une augmentation relative la plus fonctionnelle PD-1^{+ / Salut} ou cTfh2 ou cTfh17 des sous-ensembles en comparaison avec le moins Functional PD-1^– et/ou de sous-ensembles de cTfh1¹². L’ampleur de ces changements souvent associé avec des paramètres cliniques, y compris les titres de l’activité et les auto-anticorps maladie, indiquant un rôle potentiel de distribution sous-ensemble cTfh comme biomarqueur pronostique dans la maladie, qui pourrait refléter l’activité de Tfh dans les tissus lymphoïdes^9,12,13,14. En outre, prélever des échantillons de sang des participants est rapide, sécuritaire et acceptable et donc permet série suivi pour l’analyse de la progression de la maladie ou la réponse au traitement.

L’utilisation de CD4 isolé⁺ T-cellules sur des suspensions de cellules mononucléées (PBMNC) traditionnels circulants permet à plus haut débit écoulement cytometry des expériences en réduisant le temps nécessaire pour acquérir un nombre substantiel de cellules cTfh pour analyse. C’est particulièrement utile lorsque le tri des cellules provenant de sous-ensembles cTfh rare qui utilise les flux activé la cellule triant (FACS). Pour l’efficacité de l’aide, ces suspensions peuvent être cryogénisées pour activer le « dosage » d’échantillons pour être utilisé dans l’expérience de cytométrie de flux. Sur les tests, les CD4⁺ pureté n’a pas été réduite par cryoconservation.

Alors que les différents marqueurs différents laboratoires utilisés pour classer les cellules cTfh dans les premiers stades de leur découverte, la méthode présentée ici utilise un schéma unifié de deux groupes de marqueurs de surface cellulaire tel que proposé par Schmidt et al.^{12, 15} pour permettre l’identification simultanée des cTfh et leurs sous-ensembles reconnus neuf dans un seul écoulement cytometry expérimenter.

Comme seuls marqueurs de surface de cellules sont utilisées, les cellules ne nécessitent pas de fixation ou la perméabilisation et peuvent ainsi rester en vifs pour des études fonctionnelles en aval. Cela pourrait être facilité par la cellule de tri à l’aide de FACS avec le même panneau d’anticorps. Ce panneau pourrait être élargi afin d’inclure d’autres marqueurs, permettant à des restrictions du cytomètre en flux utilisé.

L’analyse d’expériences de cytométrie en flux multi-color peut être difficile en raison de la nature intrinsèquement subjective de blocage sur des parcelles de dot 2-dimensionnel, surtout lorsque populations cellulaires n’ont pas une distribution bimodale clair en fluorescence de marqueur, comme c’est le Etui pour cTfh cellules et de leurs sous-ensembles. Pour cette raison, il est impératif de mettre en place des contrôles efficaces pour réduire les artefacts pour permettre la meilleure résolution des populations et pour définir le déclenchement des stratégies en toute confiance. Ainsi, les anticorps panneau conception et la mise en place de contrôles de base pour un écoulement cytometry experiment, c'est-à-dire, à l’aide de la compensation et FMO contrôles sont décrites à l’étape 3.4.2 et 3.4.3,respectively.

Toutes les cellules cTfh sont définis comme CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. Le niveau d’expression du marqueur d’activation Tfh caractéristique PD-1 peut décider pour identifier les sous-ensembles de PD-1^-, PD-1⁺ ou cellules^Salut cTfh PD-1. Puis, en utilisant une combinaison des récepteurs de chimiokine CXCR3 et CCR6, qui sont exprimés de façon traditionnelle Th1, 2 ou 17 cellules, cTfh peuvent être caractérisées comme cTfh1, 2 ou 17-like par un profil de CXCR3⁺ CCR6^-, CXCR3^– CCR6^- et CXCR3^– CCR6⁺, respectivement.

Le panneau des anticorps utilisé par notre laboratoire est affiché dans le tableau 1. L’utilisateur peut avoir à adapter leur sélection de fluorophore pour tenir compte pour le laser et la configuration de filtrage de la lumière disponible sur leur cytomètre de flux local.

Les considérations suivantes influent sur le choix des fluorophores. Utilisez des fluorophores lumineux lorsque c’est possible. En particulier, utilisez les plus brillants fluorophores disponibles sur les marqueurs plus sombre (moins fortement exprimés). Gradateurs marqueurs incluent PD-1, CXCR3 et CCR6 et dans une moindre mesure, CXCR5. Nous avons fait spécifiquement utiliser le nouveau BB, BV et BUV fluorophores qui offrent une luminosité et ainsi permettre une résolution plus facile des populations distinctes des cellules.

Étend la sélection de fluorophore sur les spectres d’émission autant que possibles réduire au minimum le chevauchement spectrale et donc le niveau de compensation nécessaire. Un outil gratuit et en ligne qui peut être utilisé pour aider à concevoir un panneau de cytométrie de flux peut être trouvé ici : http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Pour économiser l’espace sur le spectre d’émission, nous avons utilisé un « canal de décharge » en utilisant un colorant de la viabilité d’une longueur d’onde d’émission qui chevauche celui de APC-H7 (conjugué à CD45RA) afin de permettre la détection et exclusion des deux morts et/ou CD45RA⁺ en utilisant un détecteur unique.

Ici, un protocole est présenté pour l’isolation du sang périphérique CD4⁺ T-cellules et leur analyse ultérieure par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des différents et récemment décrite sous-ensembles en circulation.

Protocole

Des échantillons de sang ont été prélevés des sujets normaux (NS) (n = 12) ainsi que des patients atteints de lymphome (MZL) de la zone marginale (n = 7) et d’autres types de cellules B lymphome non hodgkinien-(BNHL) (FL 6 patients, 2 patients de lymphome lymphoplasmocytique et 1 bas grade B-cellule lymphome non-hodgkinien non précisés patient). Les patients ont été recrutés dans les cliniques d’hématologie à Leicester Royal Infirmary, après avoir donné a informé, le consentement écrit, avec l’approbation éthique mis en place pour toutes les études. Approbation éthique a été obtenue par le Leicestershire, Northamptonshire et Rutland recherche éthique comité 1 référence 06/Q2501/122 pour les échantillons de patients et de l’autorité HRA (Health Research Authority) NRES Comité East Midlands-Derby, référence 14/EM/1176 pour sujets normaux.

1. isolement des CD4⁺ lymphocytes du sang périphérique ensemble

1. Prendre du sang périphérique (2 à 15 mL) en K les₂tubes EDTA par ponction veineuse standard et processus dès que possible pour maintenir la viabilité maximale.
   Remarque : Utiliser l’équipement de protection individuelle standard de laboratoire (manteau, gants, lunettes) et réaliser les travaux dans une enceinte de sécurité biologique II de classe.
2. Apporter le sang et tous les réactifs nécessaires (CD4⁺ enrichissement cocktail, 2 % fœtale bovine sérique/tamponné phosphate salin (FBS/PBS), média gradient de densité et congélation moyen si la cryoconservation des cellules) à température ambiante.
3. Mélanger le sang avec un cocktail disponible dans le commerce des anticorps pour l’enrichissement des CD4 humain⁺ des cellules T. Utilisez 50 µL de réactif pour chaque 1 mL de sang. Utiliser un tube en polypropylène conique de 50 mL pour 5 à 15 mL de sang.
   Remarque : Si à l’aide de 2 à 4 mL de sang, effectuez cette étape dans un tube en polypropylène conique 14 mL.
4. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.
5. Diluer le mélange avec un volume égal de 2 % FBS/PBS
6. Couche de ce mélange dilué sur le dessus de la média de gradient de densité lentement pour éviter de déranger l’interface et de procéder à une centrifugation immédiatement pour éviter la diffusion du sang dans le milieu de gradient de densité.
   1. Pour 2 à 3 mL de sang, utiliser 3 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène à fond conique 14 mL, mais 4 ml de sang, utiliser 4 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène conique 14 mL et de 5 à 15 mL de sang , utiliser 15 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène conique de 50 mL.
7. Centrifuger le mélange de couches pendant 20 min à 1 200 g avec le frein au large à 20 ° C.
   Remarque : Une température inférieure à l’environnement peut entraîner la contamination par les globules rouges et des granulocytes. Une vitesse inférieure provoquera le CD4⁺ échec du processus d’isolement. Laissant la pause engagée diminuera le rendement cellulaire. Utiliser une centrifugeuse de paillasse albums avec rotors qui peuvent être fermés pour éviter les aérosols.
8. Supprimer le CD4 enrichi⁺ couche de cellules à partir de l’interface à l’aide d’une pipette Pasteur.
   Remarque : La couche de cellules enrichi ressemblera à une norme « couche leuco-plaquettaire » des cellules nuageux blancs, mais comme seulement CD4⁺ les cellules sont présentes, ce sera naturellement plus petites et plus difficiles à voir.
9. Ajouter 2 % FBS/PBS pour le CD4 des cellules jusqu'à un volume total de 10 mL et puis laver deux fois avec 2 %⁺ FBS/PBS par centrifugation pendant 10 min à 400 x g lors de chaque lavage.
10. Resuspendre le culot dans 2 % FBS/PBS et comte les cellules colorent avec un colorant vital (le bleu trypan) pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité.
11. Étape facultative : remettre en suspension de 5 x 10⁵ à 1 x 10⁶ cellules de congélation moyen (10 % diméthylsulfoxyde dans FBS) en aliquotes de 1 mL.
    Remarque : Niveaux de certains marqueurs de surface peuvent être modifiés par cryo-préservation et du dégel. Il est donc très important que tous les échantillons sont systématiquement traités. Afin de minimiser les différences dans les variables de l’analyses, les échantillons ont été cryoconservés et par lot pour analyse dans la présente étude.

2. cytométrie en flux

1. Décongeler le CD4 cryoconservés⁺ cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C et lavage une fois dans préchauffé moyen (RPMI 1640 + L-glutamine, additionné de 10 % de SVF et 1 x pénicilline-streptomycine).
2. Ajouter les cellules dans 9 mL de milieu, centrifuger pendant 5 min à 400 x g et éliminer le surnageant.
3. Remettre en suspension les cellules de 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS (50 µL) afin que chaque condition à tester utilise entre 5 x 10,⁵ et 1 x 10⁶ cellules.
4. Mélanger les cellules avec du tampon de coloration (50 µL).
   Remarque : Tampon de tache brillante empêche divers artefacts de coloration qui peuvent interférer avec l’analyse des données, lorsque deux ou plusieurs taches de BV ou BUV sont utilisés en même temps en raison des propriétés chimiques intrinsèques de ces colorants. Dans des conditions simples ou non colorées, les 50 µL de tampon de tache brillante peut être substituée à 50 µL de 1 % BSA/PBS.
5. Ajouter les anticorps aux cellules (selon le « volume utilisé » colonne dans le tableau 1) et incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 30 min.
6. Laver les cellules deux fois chez 1 % BSA/PBS par centrifugation pendant 3 min à 600 x g lors de chaque lavage.
7. Remettre en suspension dans 1 % BSA/PBS (400 µL) et transférez dans un tube d’acquisition de cytométrie de flux.
8. Vortex les cellules doucement avant d’acquérir des données sur un cytomètre en flux :

3. régulateur de mise en place et les contrôles de la cytométrie en flux

1. En utilisant un échantillon non coloré, définissez photodiode tensions afin que les lymphocytes se distingues des débris évident et les cellules mortes (événements avec zone de diffusion (SSC) côté haut et faible dispersion vers l’avant (FSC))¹⁶. À l’aide de simples échantillons colorés, régler photomultiplicateur (PMT) tensions afin que la fluorescence positive peut discerner de fluorescence de fond tout en s’assurant que tous les événements relèvent de l’échelle détectable.
   Remarque : Une amélioration consisterait à tracer CV contre les surtensions du PMT pour chaque PMT à l’aide de perles faiblement fluorescents pour trouver la tension minimale pour optimiser la résolution (la méthode « Peak 2 »¹⁹).
2. Compte de chevauchement spectrale en générant une matrice de compensation à l’aide de simples taches avec des perles de capture. Ajouter les perles de l’indemnisation disponible dans le commerce (60 µL) et billes de contrôle négatif (60 µL) à 1 % BSA/PBS (100 µL) et vortex.
   Remarque : Les perles de capture utilisés doivent correspondre à l’espèce hôte et IgG isotype de l’anticorps utilisé. La matrice de la compensation devrait être recalculée si le numéro de lot de n’importe quel tandem colorants changements, car ils peuvent afficher une variabilité considérable dans leurs spectres d’émission entre les lots.
3. Ajouter un seul anticorps (20 µL) et vortex.
4. Incuber dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.
5. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
6. Resuspendre dans 1%BSA/PBS (500 µL) et vortex.
7. Acquérir l’échantillon avec un cytomètre en flux à l’aide du générateur de matrice de rémunération désigné dans le logiciel d’acquisition selon les instructions du fabricant.
8. Utiliser les contrôles FMO pour guider le placement des portes pour fluorescence marqueur positif tenir compte des déversements de colorant, qui est la principale source de fluorescence de fond dans les expériences à l’aide de ≥ 4 couleurs¹⁶. Suivez la coloration de surface cellulaire générale du protocole tel que décrit à l’étape 3, mais pour chaque condition, omettre l' un des fluorophores de l’étape de coloration (où CD45RA est omis, également omettre la tache de vivre/morts). 100 000 lymphocytes pour chaque condition de l’acquisition.
9. Définir la positivité porte à ≤0. 5 % des cellules. Voir la Figure 2 pour obtenir un exemple illustré des contrôles de la FMO.

4. analyse des données

1. Employer le logiciel d’acquisition du cytomètre définir un seuil de 5 000 unités sur le paramètre FSC d’exclure les débris de très petite taille.
2. Utiliser une grille d’arrêt en vue d’acquérir 10 000 cellules cTfh (CD4⁺ CD45RA^– CXCR5⁺).
   Remarque : L’utilisateur individuel peut recueillir plus de 10 000 cellules. Ce nombre était un compromis entre la collecte suffisamment de cellules pour fournir des résultats significatifs et le temps nécessaire à la collection.
3. À l’aide d’une superficie de FSC / parcelle de SSC-zone de dot, dessinez une ellipse ou polygone porte pour sélectionner la population de lymphocytes, tout en excluant les débris et ouvertement la mort des cellules (événements avec un SSC-région haute et basse FSC-zone).
4. À l’aide d’une superficie de FSC / parcelle de FSC-largeur dot, dessiner un polygone gate pour sélectionner des cellules individuelles tout en excluant les doublets (les doublets ont une superficie accrue mais largeur semblable aux cellules individuelles).
5. À l’aide d’une superficie de FSC / marqueur CD45RA et viabilité point intrigue, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner direct, CD45RA^– (cellules avec une fluorescence faible pour ce marqueur).
6. À l’aide d’une superficie de FSC / CD4 point intrigue, dessiner une porte rectangulaire pour sélectionner CD4⁺ (cellules avec une fluorescence élevée de ce marqueur).
7. En utilisant un CD4 / CXCR5 point tracé, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner CXCR5⁺ (c.-à-d. cTfh) des cellules (cellules avec une fluorescence élevée de ce marqueur).
8. À l’aide d’un CXCR3 / CCR6 terrain de dot, placez une quadruple gate à subdiviser les cellules cTfh cTfh1, 2 et 17 (cellules qui sont hautes et basses pour chaque marqueur).
   Remarque : Les cellules avec le phénotype CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ sont mal caractérisé. Nous appelons ces cellules cTfh1/17¹⁸ parce que les cellules T helper classique (CD4⁺ CXCR5^–) qui sont en transition entre l’expression voir la Th17 et Th1 de CXCR3 et CCR6 et ont été décrits comme cTfh1/17¹⁹.
9. À l’aide d’un histogramme de PD-1, utilisez l’outil de la gamme pour subdiviser les cellules cTfh (ou si l'on préfère, les cTfh1 individuels, sous-ensembles 2, 17 ou 1/17) en PD-1^{-/ +} ou le ^Salut des populations.
   Remarque : La distinction entre PD-1⁺ et PD-1^Salut n’est pas bien définie dans la littérature. Le seuil a été fixé comme la même intensité de PD-1, nécessaire pour la détection des và © ritable Tfh dans des suspensions de lymphocyte humain amygdale utilisant l’écoulement cytometry avec le même panneau d’anticorps. Alternativement, un marqueur d’ICOS peut être ajouté du panel d’anticorps, comme seules PD1^Salut cellules sont ICOS⁺.

Résultats

CD4 élevé⁺ pureté a été réalisée en utilisant le CD4⁺ protocole d’isolement, qui était fiable dans l’ensemble de tous les échantillons de sang testé par nos soins (signifie : 96,6 %, SD : 2.38, n = 31) (Figure 3).

Identification du cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ cellules) chez un sujet normal représentatif est présenté (Figure 4<...

Discussion

Ce protocole représente un moyen simple et efficace pour analyser les cellules du sang périphérique cTfh, permettant la détection de tous les sous-ensembles pertinentes identifiées jusqu'à présent dans la littérature. Des échantillons de sang peuvent procurer facilement et efficacement comme partie du standards cliniques ambulatoires et des échantillons de la série peut être collecté en parallèle avec les données cliniques. À son tour, cela permet des études prospectives évaluant cTfh sous-ensembles com...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973