CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

요약

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜⁺ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화⁺ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

초록

탈 T follicular 도우미 (Tfh) 셀 활동은 자기 면역 조건에서 감지 하 고 B-세포 비-Hodgkin의 림프 종에서 림프 노드 microenvironment 분석은 그들의 존재는 임상 결과와 관련. T follicular 도우미 셀 (cTfh), 혈액에 Tfh 셀의 순환 메모리 구획 순환의 하위 집합 또한 질병에서 불안정 하 고 따라서 잠재적인 새로운 예측 생체를 나타냅니다. 주변 혈액 기반 테스트 상대적으로 비 침략 적 이며 간단한 직렬 모니터링 수 있기 때문에 유리 하다. 이 문서는 CD4 격리 하기 위한 방법을 설명 합니다⁺ T-세포, 인간의 혈액과 cytometry cTfh 세포와 그들의 다양 한 하위 집합의 비율을 열거 하 여 추가 분석에서 (cTfhPD-1^{-/ + / 안녕}, cTfh1, 2, 17, cTfh1/17). 이러한 하위 수준 다음 림프 종으로 일반 과목과 환자 사이 비교 되었다. 우리는 방법을 정기적으로 수집한 환자 자료에서 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 충분히 강력한 발견. 기술 분석에 대 한 설명 셀 정렬 및 RT-PCR 같은 다운스트림 응용 프로그램에 쉽게 적응 될 수 있다.

서문

T-follicular 도우미 셀 (Tfh)는는 CD4⁺ 림프 조직¹에서 처음 특징은 T 세포 부분 집합. 이러한 세포 PD-1, CXCR5 표면 수용 체를 표현 하 고 IL-21 및 IL-4 분 비 녹음 방송 요인, BCL-6^2,3의 핵 식 표시. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 그들은 어린 싹 센터에서 발견 되 고 높은 친 화력 항 체 생산¹에 필수적인.

Dysregulated Tfh 응답 질병 병 인, 특히 자가 면역 질환, 그들은 autoreactive B 세포⁴의 확장을 추진 하는 어디에 연루 되었습니다. 그들은 또한 단단한^5,6 의 림프 암⁷종양 microenvironment에서 역할을 재생할. 반대로, Tfh 필수적인 표면 단백질의 유전자 결함 인간 면역 결핍 증후군⁸T-셀 costimulator (ICOS) 결과 유도할 수 있는 등 기능. CD4⁺ CXCR5⁺ 인간의 말 초 혈액에서 순환 T-follicular 도우미 셀 (cTfh) 불린다 전지와 Tfh 세포 조직⁹에서 메모리 구획 될 것으로 추정 된다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 CD4 다음 cTfh 하위 집합의 분석⁺ 세포 주변 혈액 샘플에서 격리.

여러 cTfh 하위 집합 정의 하는 그들은 B-세포 도움을 제공 하는 효율성 다른^9,10,,1112하나의 하위 집합에서 다릅니다. 대부분 눈에 띄게 면역 질환 있는 거기는 거의 항상 더 기능 PD-1에서 상대 증가 질병의 숫자에서 변경 되는 이러한 하위 집합의 상대적 비율^{+ 안녕} 또는 cTfh2 또는 cTfh17 하위 집합 덜에 비해 기능 PD-1^- 또는 cTfh1 하위 집합¹². 이러한 변경의 정도 자주 질병 활동과 autoantibody titers Tfh에서의 활동을 반영 될 수 있습니다 질병에서 예 후 바이오 마커로 cTfh 하위 집합 배포의 잠재적인 역할을 나타내는 등 임상 매개 변수 연관 림프 조직^9,12,,1314. 또한, 참가자에 게 서 혈액 샘플을 채취는 빠르고, 안전 하 고, 허용 하며 그래서 직렬 질병의 진행 이나 치료에 응답의 분석에 대 한 모니터링

고립 된 c d 4 사용 하 여⁺ T-세포 전통적인 주변 혈액 단 셀 (PBMNC) 정지 이상 분석에 대 한 cTfh 셀의 상당한 수를 확보 하는 데 필요한 시간을 줄여 높은 처리량 흐름 cytometry 실험 수 있습니다. 이 흐름을 사용 하 여 희귀 cTfh 하위 집합에서 셀 정렬 셀 정렬 (FACS) 활성화 될 때 특히 도움이 됩니다. 효율성을 투입,이 정지 "일괄 처리" 교류 cytometry 실험에 사용 되는 샘플의 사용을 cryopreserved 수 있습니다. 테스트는 CD4⁺ 순도 cryopreservation 하지 감소 했다.

세포 표면 마커 슈미트 외.^12, 에 의해 제안 된로 두 그룹의 통합된 체계의 사용 여기에 그들의 발견, 방법의 초기 단계에서 cTfh 셀 분류를 사용 하는 다른 실험실 다른 마커 제시 하는 동안 ¹⁵ cTfh 및 단일 cytometry에 그들의 9 인식된 하위 집합의 동시 식별 수 있도록 실험.

유일한 세포 표면 마커를 사용 하는 셀 고정 또는 permeabilization, 필요 하지 않은 고 따라서 다운스트림 기능 연구에 대 한 살아으로 남아 있을 수 있습니다. 이 같은 항 체 패널 FACS를 사용 하 여 정렬 하는 세포에 의해 촉진 수 있습니다. 이 패널 교류 cytometer 사용의 제한에 대 한 허용 하는 다른 마커를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다.

멀티 컬러 흐름 cytometry 실험의 분석 특히 때 세포 인구에에서 필요가 없습니다 분명 bi 모달 배포 마커 형광는 2 차원 점 작에 게이팅의 본질적으로 주관적인 성격 때문에 도전적 일 수 있다는 cTfh 세포와 그들의 하위 집합에 대 한 케이스입니다. 이러한 이유로, 그것은 인구의 더 나은 해상도 사용 하도록 설정 하 고 전략을 자신 있게 게이팅 설정 유물을 줄이기 위해 효과적인 컨트롤을 설정 하는 것이 필수적. 이와 같이 항 체 패널 디자인과 cytometry에 대 한 기본 컨트롤 설정 실험, 즉, 보상을 사용 하 여 및 FMO 컨트롤 단계 3.4.2와 3.4.3,respectively에 설명 되어 있습니다.

모든 cTfh 세포 CD4로 정의 된⁺ CXCR5⁺ CD45RA^-. 표현의 특성 Tfh 활성화 마커 PD 1의 수준 하위 집합 PD-1^-의 PD-1⁺ 또는 PD-1^{안녕하세요} cTfh 셀을 식별 하기 위해 다음 확인할 수 있습니다. 그런 다음, chemokine 수용 체 CXCR3 및 CCR6의 조합을 사용 하 여, 전통적인 Th1, 2 또는 17 셀, cTfh에 의해 표현 된 차동 나타낼 수 있다 cTfh1, 또는 CXCR3의 프로 파일에 의해 17-같은 2로⁺ CCR6^-, CXCR3^- CCR6^- , 및 CXCR3^- CCR6⁺, 각각.

우리의 실험실에서 사용 하는 항 체 패널은 표 1에 표시 됩니다. 사용자 자신의 로컬 교류 cytometer에서 사용할 수 있는 레이저와 빛 필터 구성에 대 한 계정에 그들의 fluorophore 선택 적응 해야 합니다.

다음 사항을 fluorophores의 영향. 가능한 경우 밝은 fluorophores를 사용 합니다. 특히, 흐릿한 (매우 보다 적게 표현된) 표식에 밝은 사용할 수 fluorophores를 사용 합니다. 주차 마커 포함 PD-1, CXCR3 및 CCR6, 그리고 조금 적게, CXCR5. 우리는 특히 BB, BV와 BUV의 최신 사용 하 여 만든 fluorophores 우수한 밝기를 제공 하 고 이렇게 세포의 고유한 인구의 쉽게 확인 가능.

Fluorophore 선택 방출 스펙트럼 스펙트럼 중복 및 따라서 요구 하는 보상의 수준을 최소화 하기 위해 가능한 한 많이 분산. 교류 cytometry 패널 설계를 지원 하기 위해 사용할 수 있는 무료 온라인 도구를 여기서 찾을 수 있습니다: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. 방출 스펙트럼에 공간을 절약 하기 위해 우리는 모두 죽은 감지 (및 제외) APC H7 (CD45RA 활용)와 겹치는 방출 파장을 가진 생존 염료를 사용 하 여 "덤프 채널"를 고용 또는 CD45RA⁺ 를 사용 하는 단일 탐지기입니다.

여기, 프로토콜 cytometry 다르고 최근 설명 순환 하위 집합의 비율을 결정 하 여 말 초 혈액 CD4의 절연은⁺ T-세포 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.

프로토콜

혈액 샘플은 일반 과목 (NS)에서 가져온 (n = 12) 한계 영역 림프 종 (MZL) 환자 뿐만 아니라 (n = 7) B-세포 비-Hodgkin의 림프 종 (BNHL) (6 층 환자, 2 lymphoplasmacytic 림프 종 환자와 1 학년 B-세포의 비-Hodgkin의 림프 종 하지 않으면 지정 환자). 환자는 후 부여 하는 데, 장소에서 모든 연구에 대 한 윤리적인 승인을 서 면된 동의 레스터 로얄 실에서 혈액학 클리닉에서 채용 했다. 레스터, 노스 햄프셔와 러 틀 랜드 연구 윤리 위원회 1, 06/Q2501/122 환자 샘플 및 건강 연구 기관 (HRA) NRES 위원회 동부 미들 랜드 더비에 대 한 참조에 의해 윤리적인 승인을 얻은, 14/EM/1176에 대 한 참조 일반 과목입니다.

1. 절연 CD4의⁺ 전체 말 초 혈액에서 T-세포

1. K₂EDTA 튜브 신선한 말 초 혈액 (2 ~ 15 mL) 표준 venipuncture 및 프로세스 최대 생존을 유지 하기 위해 가능한 한 빨리 가져가 라.
   참고: 표준 실험실 개인 보호 장비 (코트, 장갑, 안경)을 사용 하 고 클래스 2 Biosafety 내각에서에서 업무를 수행.
2. 혈액 및 모든 필요한 시 약 (CD4⁺ 농축 칵테일, 식 염 2% 태아 둔감 한 혈 청/인산 버퍼 (FBS/PBS), 밀도 그라데이션 미디어, 그리고 동결 매체 경우 셀 cryopreserving) 실내 온도에.
3. 인간의 CD4의 농축에 대 한 항 체의 상용 칵테일 피 믹스⁺ T 세포. 시 약의 50 µ L를 사용 하 여 혈액의 각 1 ml. 혈액의 5 ~ 15 ml 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용 합니다.
   참고: 2 ~ 4 mL의 혈액을 사용 하 여, 만약 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에이 단계를 수행 합니다.
4. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
5. 2%의 동등한 양으로 혼합 희석 FBS/PBS
6. 이 희석된 혼합 밀도 그라데이션 미디어 인터페이스를 방해 하지 않도록 고 밀도 그라데이션 중간에 혈액의 확산 방지에 즉시 원심 분리를 천천히 위에 레이어.
   1. 혈액의 2 ~ 3 mL, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 혈액의 4 ml 3 mL 밀도 그라데이션 매체의 사용, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 ~ 15 mL 혈액에 대 한 밀도 그라데이션 매체의 4 mL를 사용 밀도 그라데이션 매체의 15 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 사용.
7. 20 ° c.에 떨어져 브레이크 1200 x g 20 분에 대 한 계층화 된 혼합물을 원심
   참고: 아래 주위 온도 적혈구와 granulocytes 오염 될 수 있습니다. 낮은 속도 CD4 하면⁺ 실패 격리 프로세스. 종사 하는 휴식을 떠나 셀 생산량을 줄일 것 이다. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여에 어로 졸을 피하기 위해 폐쇄 될 수 있습니다로 터와.
8. 풍부한 CD4 제거⁺ 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에서 셀 레이어.
   참고: 풍부한 셀 레이어 표준 "버 피 코트" 흰색 흐린 셀, 하지만 CD4만 닮은 것 이다⁺ 세포는 존재,이 자연스럽 게 작고 더 어려운 볼 수 있을 것입니다.
9. 추가 2 %FBS / PBS는 CD4에⁺ 10ml 2%로 두 번 다음 세척의 총 볼륨까지 셀 400 x g 에서 10 분 동안 각 세척 centrifuging 의해 FBS/PBS.
10. 펠 릿 2%에서 resuspend 셀 셀 번호 및 생존 능력을 결정 하는 중요 한 염료 (trypan blue)로 얼룩진 FBS/PBS 및 수.
11. 선택적 단계: 5 x 10⁵ 매체 (FBS에 10% 디 메 틸 sulfoxide) 1 mL aliquots에 1 x 10⁶ 셀에 resuspend.
    참고: 일부 표면 마커 수준의 cryo 보전 및 해빙에 의해 변경할 수 있습니다. 그것은, 따라서, 매우 중요 한 모든 샘플 지속적으로 처리 됩니다. 분석 변수에서 차이 최소화 하기 위해 샘플 cryo 보존 하 고이 연구에서 분석에 대 한 일괄 처리 했다.

2. Cytometry

1. 해 동 cryopreserved CD4⁺ 37 ° C와 세척 한 번에 미리 따뜻하게 매체 (RPMI 1640 + L-글루타민 보충 10 %FBS 1 x 페니실린-스)에서 물 욕조에 신속 하 게 세포.
2. 매체, 400 x g 에 5 분 동안 원심 분리기의 9 mL에 셀을 추가 하 고 제거 하는 상쾌한.
3. 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 셀 resuspend (50 µ L) 5 x 10⁵ 와 1 x 10⁶ 세포 사이 사용 하는 각 상태를 테스트할 수 있도록.
4. 얼룩이 버퍼 셀 혼합 (50 µ L).
   참고: 화려한 얼룩 버퍼 두 개 이상의 BV 또는 BUV 얼룩 이러한 염료의 고유한 화학적 특성 때문에 동시에 사용 하는 경우 데이터 분석을 방해할 수 있는 다양 한 얼룩 유물을 방지 합니다. 1%의 50 µ L 단일 또는 흠 없는 조건에서 빛나는 얼룩 버퍼의 50 µ L을 대체 하실 수 있습니다 BSA/PBS.
5. (는 "볼륨 사용" 열 에서 표 1)에 의하여 세포에 항 체를 추가 하 고 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
6. 1% 셀 두 번 씻어 600 x g 에서 3 분 동안 각 세척 centrifuging 여 BSA/PBS.
7. 1%에서 resuspend BSA/PBS (400 µ L) 및 교류 cytometry 수집 튜브를 전송.
8. 소용돌이 흐름 cytometer에서 데이터를 취득 하기 전에 부드럽게 셀:

3. flow Cytometry 컨트롤 및 설정

1. 흠 없는 샘플을 사용 하 여 설정 포토 다이오드 전압 세포는 명백한 파편과 죽은 세포 (높은 측면 살포 (SSC) 지역 및 낮은 앞으로 분산형 (FSC) 지역 이벤트)¹⁶에서 분리 될 수 있다. 단일 사용 하 여 샘플, 스테인드 설정 광 전 증폭 관 (PMT) 전압 긍정적인 형광 있는지 모든 이벤트 감지 규모에 속하는 하는 동안 배경 형광에서 분별 수 있습니다.
   참고: 개선은 PMT 전압에 대 한 최적의 해상도 ("최고 2" 방법¹⁹)에 대 한 최소 전압을 찾을 어렴풋이 형광 비즈를 사용 하 여 각 PMT에 대 한 CV를 것입니다.
2. 단일 얼룩을 사용 하 여 캡처 구슬 보상 매트릭스를 생성 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 계정. 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬 (60 µ L), 및 부정적인 제어 구슬 (60 µ L) 1%를 추가 BSA/PBS (100 µ L), 및 소용돌이.
   참고: 사용 하는 캡처 구슬 호스트 종 및 사용 되는 항 체의 IgG isotype 일치 해야 합니다. 보상 매트릭스 해야 다시 계산 어떤 협동의 로트 번호 변경, 염색 하는 경우 그들은 그들의 방출 스펙트럼 제비 사이에서 상당한 가변성을 표시할 수 있습니다.
3. 단일 항 (20 µ L) 체와 소용돌이 추가 합니다.
4. 30 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 품 어.
5. 10 분 동안 200 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
6. 1%BSA/PBS에서 resuspend (500 µ L) 및 소용돌이.
7. 제조업체의 지침에 따라 수집 소프트웨어에서 지정 된 보상 매트릭스 생성기를 사용 하 여 교류 cytometer와 샘플을 획득 합니다.
8. 사용 FMO 컨트롤 ≥4 색상¹⁶를 사용 하 여 실험에 배경 형광의 주요 원천입니다, 염료 유출에 대 한 계정에 긍정적인 마커 형광에 대 한 빌 게이츠의 위치를 안내 합니다. 따라 하지만 각 조건에 대해 3 단계에서에서 설명한 대로 프로토콜 일반 세포 표면 얼룩이 하나 얼룩 단계에서 fluorophores의 생략 (CD45RA 생략 하는 곳 또한 생략 라이브/죽은 얼룩). 각 조건에 대 한 100000 세포를 획득 합니다.
9. 셀의 ≤0.5 %에서 게이트 양성을 설정 합니다. FMO 컨트롤의 그림 예 그림 2 를 참조 하십시오.

4. 데이터 분석

1. 매우 작은 파편을 제외 하는 FSC 매개 변수에 5000 단위의 임계값을 설정할 흐름 cytometer 수집 소프트웨어를 사용 합니다.
2. 10000 cTfh 세포를 중지 게이트를 사용 (CD4⁺ CD45RA^- CXCR5⁺).
   참고: 개별 사용자는 10000 이상 세포를 수집할 수 있습니다. 이 숫자는 의미 있는 결과 컬렉션에 대 한 시간을 제공 하기 위해 충분 한 세포를 수집 사이 타협 이었다.
3. FSC-영역을 사용 하 여 / SSC-지역 점 플롯, 파편을 제외 하는 동안 세포의 인구를 선택 하는 타원 또는 다각형 게이트 그리고 명백 하 게 죽은 세포 (높은 SSC-지역 및 낮은 FSC-지역 이벤트).
4. FSC-영역을 사용 하 여 / FSC 폭 점 플롯, 다각형을 그리기 게이트 남자 (남자는 단일 셀에 비슷한 폭 하지만 증가 지역)을 제외 하는 동안 단일 셀을 선택.
5. FSC-영역을 사용 하 여 / CD45RA 및 생존 표식 점 플롯, 라이브, CD45RA 선택 사각형 게이트 그릴^- 셀 (이 표식에 대 한 낮은 형광으로).
6. FSC-영역을 사용 하 여 / CD4 점 플롯, CD4 선택 사각형 게이트 그릴⁺ 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).
7. c d 4를 사용 하 여 CXCR5 점 플롯, / CXCR5 선택 사각형 게이트 그릴⁺ (즉, cTfh) 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).
8. CXCR3을 사용 하 여 / CCR6 점 줄거리, 장소 쿼드로 cTfh1, cTfh 세포를 세분 하 게이트 2와 17 셀 (셀 및 로우 각 표식에 대 한).
   참고: 셀 형 CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ 는 가난 하 게 특징. 우리가 이러한 셀 참조 cTfh1/17¹⁸ 로 때문에 기존의 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ CXCR5^-)는 Th1과 Th17 쇼 표현의 CXCR3와 CCR6 사이 전환 하 고 cTfh1/17¹⁹로 설명 되었습니다.
9. 범위 도구를 사용 하 여 cTfh 세포를 세분 하는 PD 1 히스토그램을 사용 하 여 (또는 경우, 개별 cTfh1 2, 17 또는 1/17 하위 선호) PD-1^{-/ +} 또는 ^안녕 인구.
   참고: PD-1⁺ 와 PD-1^{안녕하세요} 의 차이 문학에서 잘 정의 되지 않습니다. 임계값은 선의의 Tfh 인간의 편도 선 림프 구 정지 같은 항 체 패널 cytometry 사용 하 여 검색 하는 데 필요한 같은 PD 1 강도로 설정 했다. 또는, PD1^{안녕하세요} 셀만 ICOS⁺는 ICOS에 대 한 마커 항 체 패널에 추가할 수 있습니다.

결과

높은 CD4⁺ 순도 c d 4를 사용 하 여 달성 되었다⁺ 회사에 의해 했다 모든 혈액 샘플에서 신뢰할 수 있는 격리 프로토콜 테스트 (의미: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (그림 3).

CTfh의 식별 (CD4⁺ CXCR5⁺ 세포) 대표 정상적인 주제에(그림 4)제공 됩니다. CD4 내?...

토론

이 프로토콜 분석 주변 혈액 cTfh 셀, 지금까지 문학에서 확인 된 모든 관련 하위 집합의 검색을 활성화 하 간단 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 혈액 샘플 얻어질 수 있다 쉽고 효율적으로 표준 외래 환자 진료소와 직렬 샘플의 일부 임상 데이터와 동시에 수집 될 수 있습니다. 차례 차례로, 질병의 진행 이나 치료에 대 한 생체로 cTfh 하위 집합을 평가 하는 예비 연구 수 있습니다. 이러한 연구?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973