Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori

Riepilogo

Qui, un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di CD4⁺ cellula T sottoinsiemi da sangue periferico umano è descritto. Purificato CD4⁺ T-cellule sono analizzate tramite flusso cytometry per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi delle cellule helper T-follicolare.

Abstract

L'attività cellulare aberrante T-follicolare helper (Tfh) è rilevabile nelle patologie autoimmuni e la loro presenza è associata con i risultati clinici quando viene analizzato il microambiente di linfonodo nel linfoma non-Hodgkin della B-cellula. Sottoinsiemi di fare circolare le cellule helper T-follicolare (cTfh), il vano memoria circolanti di Tfh cellule nel sangue, sono anche turbati nella malattia e pertanto rappresentano potenziali nuovi biomarcatori predittivi. Test basati su sangue periferico è vantaggioso perché è relativamente non-invasiva e permette il semplice monitoraggio seriale. Questo articolo viene descritto un metodo per isolare i CD4⁺ T-cellule da sangue umano e un'ulteriore analisi di citometria a flusso per enumerare le cellule cTfh e le proporzioni dei loro vari sottoinsiemi (cTfhPD-1^{-/ + / Ciao}, cTfh1, 2, 17 e 17/cTfh1). Il livello di questi sottoinsiemi è stato poi confrontato tra soggetti normali e pazienti con linfoma. Abbiamo trovato che il metodo era abbastanza robusto per ottenere risultati affidabili da materiale paziente ordinariamente raccolto. La tecnica che descriviamo per l'analisi può essere facilmente adattata a ordinamento delle cellule e applicazioni a valle come RT-PCR.

Introduzione

Le cellule helper T-follicolari (Tfh) sono un CD4⁺ subset di cellule T che inizialmente è stato caratterizzato in tessuti linfoidi¹. Queste cellule esprimono PD-1 e i ricevitori di superficie di CXCR5, secernono IL 21 e IL-4 e mostrano l'espressione nucleare di fattore di trascrizione, BCL-6^2,3. Come suggerisce il nome, si trovano in centri germinali e sono essenziali per la produzione di alta affinità dell'anticorpo¹.

Le risposte Dysregulated Tfh sono state implicate nella patogenesi della malattia, in particolare malattia autoimmune, dove essi promuovere l'espansione di cellule B autoreattive⁴. Hanno anche un ruolo nel microambiente tumorale di solido^5,6 e di cancri linfoidi⁷. Al contrario, difetti genetici delle proteine di superficie essenziale per Tfh funzionano come risultato di costimolatore (ICOS) T-cellula inducibile nelle sindromi di immunodeficienza umana⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ cellule nel sangue periferico umano sono chiamate a fare circolare le cellule helper T-follicolari (cTfh) e sono credute per essere lo spazio di memoria del Tfh cellule in tessuti⁹. Lo scopo del metodo descritto qui è l'analisi dei sottogruppi di cTfh seguito di CD4⁺ cella di isolamento da campioni di sangue periferico.

Sono stati definiti diversi sottoinsiemi di cTfh e l'efficienza con cui essi forniscono aiuto della B-cellula è diverso da un sottoinsieme di un altro^9,10,11,12. Le proporzioni relative di questi sottoinsiemi sono alterate in un certo numero di malattie, la maggior parte delle malattie autoimmuni prominente in cui c' sono quasi sempre un aumento relativo nel più funzionale PD-1^{+ / Ciao} e/o sottoinsiemi di cTfh2 o cTfh17 in confronto a meno funzionale PD-1^– e/o cTfh1 sottoinsiemi¹². La portata di tali modifiche associato frequentemente con i parametri clinici, compresi titoli di attività e di autoanticorpi malattia, che indica un ruolo potenziale della distribuzione sottoinsieme cTfh come biomarcatore prognostico nella malattia, che può riflettere l'attività del Tfh in tessuti linfoidi^9,12,13,14. Inoltre, prendendo campioni di sangue da parte dei partecipanti è veloce, sicuro ed accettabile e così permette seriale monitoraggio per l'analisi della progressione della malattia o della risposta alla terapia.

L'uso di CD4 isolato⁺ T-cellule sopra sospensioni di cellule mononucleari (PBMNC) tradizionale sangue periferico consente maggiori esperimenti di citometria a flusso di throughput riducendo il tempo necessario per acquisire un numero consistente di cellule cTfh per l'analisi. Ciò è particolarmente utile quando l'ordinamento celle da sottoinsiemi di rara cTfh usando flusso attivato cella ordinamento (FACS). Per favorire l'efficienza, queste sospensioni possono essere crioconservate per attivare la "modalità batch" di campioni da utilizzare nell'esperimento di citometria a flusso. Il test, il CD4⁺ purezza non è stata ridotta di crioconservazione.

Mentre diversi marcatori diversi laboratori utilizzati per classificare le cellule cTfh nelle fasi iniziali della loro scoperta, il metodo qui presentato si avvale di un sistema unificato di due gruppi di marcatori di superficie cellulare come proposto da Schmidt et al.^{12, 15} per consentire l'identificazione simultanea di cTfh e loro sottoinsiemi riconosciuti nove in un singolo flusso cytometry esperimento.

Come vengono utilizzati solo gli indicatori di superficie delle cellule, le cellule non richiedono fissazione o permeabilizzazione e così possono rimanere vive per studi funzionali a valle. Questo potrebbe essere facilitato dalla cella ordinamento mediante FACS con lo stesso pannello di anticorpi. Questo pannello potrebbe essere esteso per includere altri marcatori, consentendo per le restrizioni del citometro a flusso utilizzato.

L'analisi di esperimenti di multi-colore flusso cytometry può essere impegnativo a causa della natura intrinsecamente soggettiva di gating su dot 2-dimensionale appezzamenti, soprattutto quando le popolazioni delle cellule non hanno una distribuzione bimodale chiaro in fluorescenza di marcatore, come è il Custodia per cTfh cellule e loro sottoinsiemi. Per questo motivo, è indispensabile impostare controlli efficaci per ridurre gli artefatti per consentire la migliore risoluzione delle popolazioni e impostare gating strategie con fiducia. Come tale, design del pannello dell'anticorpo e la messa a punto dei controlli di base per un flusso cytometry esperimento, cioè, utilizzando la compensazione e FMO controlli sono descritte al punto 3.4.2 e 3.4.3,respectively.

Tutte le cellule cTfh sono definite come CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. Il livello di espressione del marcatore di attivazione di Tfh PD-1 caratteristico quindi può essere determinato per identificare i sottoinsiemi di PD-1^-, PD-1⁺ o cellule^Ciao cTfh PD-1. Poi, usando una combinazione dei recettori delle chemochine CXCR3 e CCR6, che sono differenzialmente espressi da Th1 tradizionale, 17 o 2 celle, cTfh può essere caratterizzato come cTfh1, 2 o 17-come da un profilo di CXCR3⁺ CCR6^-, CXCR3^– CCR6^- e CXCR3^– CCR6⁺, rispettivamente.

Nella tabella 1viene visualizzato il pannello di anticorpo utilizzato dal nostro laboratorio. L'utente potrebbe essere necessario adattare la loro selezione di fluoroforo per tenere conto per il laser e la configurazione del filtro luce disponibile su loro citometro a flusso locale.

Le considerazioni seguenti influenzano la scelta di fluorofori. Ove possibile, utilizzare brillante fluorofori. In particolare, è possibile utilizzare più brillanti fluorophores disponibile sul più debole (meno altamente espressi) marcatori. Dimmer marcatori includono PD-1, CXCR3 e CCR6 e in misura minore, CXCR5. Abbiamo specificamente fatto uso delle più recenti in BB, BV e BUV fluorofori che forniscono eccellente luminosità e consentono quindi di più facile risoluzione di popolazioni distinte delle cellule.

Si sono diffuse la selezione fluoroforo attraverso lo spettro di emissione per quanto possibile per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale e quindi il livello di compensazione necessaria. Uno strumento online gratuito che può essere utilizzato per aiutare la progettazione di un riquadro di citometria a flusso può essere trovato qui: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Per risparmiare spazio sullo spettro di emissione, abbiamo impiegato un "canale di dump" utilizzando un colorante di vitalità con una lunghezza d'onda di emissione che si sovrappone a quello di APC-H7 (coniugato di CD45RA) per abilitare il rilevamento (e l'esclusione) di entrambi morti e/o CD45RA⁺ utilizzando un singolo sensore.

Qui, un protocollo è presentato per l'isolamento di sangue periferico CD4⁺ T-cellule e la loro successiva analisi di citometria a flusso per determinare le proporzioni delle diverse e recentemente descritta sottoinsiemi di circolazione.

Protocollo

I campioni di sangue sono stati ottenuti da soggetti normali (NS) (n = 12) così come i pazienti con linfoma della zona marginale (MZL) (n = 7) e altri tipi di linfoma non-Hodgkin della B-cellula (BNHL) (FL 6 pazienti, 2 pazienti affetti da linfoma lymphoplasmacytic e della B-cellula di qualità inferiore 1 linfoma non-Hodgkin non altrimenti specificato paziente). I pazienti sono stati reclutati dalle cliniche di Ematologia presso Leicester Royal Infirmary, dopo aver dato informato, consenso scritto, con approvazione etica in luogo per tutti gli studi. Approvazione etica è stata ottenuta da Leicestershire, Northamptonshire e Rutland ricerca etica Comitato 1, riferimento 06/Q2501/122 per campioni dei pazienti e l'autorità di ricerca di integrità (integrità) NRES Comitato East Midlands-Derby, riferimento 14/EM/1176 per soggetti normali.

1. isolamento di CD4⁺ T-cellule da sangue intero periferico

1. Prendere fresco sangue periferico (2 a 15 mL) in provette EDTA di K₂di venipuntura standard e processo appena possibile per mantenere la massima redditività.
   Nota: Utilizzare dispositivi di protezione individuale a standard di laboratorio (cappotto, guanti, occhiali) e svolgere il lavoro in una classe II biosicurezza Cabinet.
2. Portare il sangue e tutti i reagenti necessari (CD4⁺ arricchimento cocktail, 2% fetale bovino siero/tamponato fosfato salino (FBS/PBS), media di gradienti di densità e congelamento medio se cryopreserving cellule) a temperatura ambiente.
3. Mescolare il sangue con un commercialmente disponibile cocktail di anticorpi per l'arricchimento di CD4 umana⁺ le cellule di T. Utilizzare 50 µ l del reagente per ogni 1 mL di sangue. Utilizzare un tubo conico in polipropilene di 50 mL per 5 a 15 mL di sangue.
   Nota: Se si utilizza 2-4 mL di sangue, è possibile eseguire questo passaggio in un tubo conico in polipropilene di 14 mL.
4. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min.
5. Stemperate il composto con un volume uguale di 2% FBS/PBS
6. Strato di questa miscela diluita in cima i media di gradienti di densità lentamente per evitare di disturbare l'interfaccia e procedere alla centrifugazione immediatamente per evitare la diffusione del sangue nel mezzo del gradiente di densità.
   1. Per 2 o 3 mL di sangue, usare 3 mL di terreno di gradienti di densità in un tubo conico in polipropilene di 14 mL, ma per 4 mL di sangue, usare 4 mL di terreno di gradienti di densità in un tubo conico in polipropilene di 14 mL e per 5-15 mL di sangue , utilizzare 15 mL di terreno di gradienti di densità in un tubo in polipropilene coniche da 50 mL.
7. Centrifugare la miscela stratificata per 20 min a 1.200 x g con il freno fuori a 20 ° C.
   Nota: Una temperatura sotto ambientale può provocare una contaminazione con globuli rossi e granulociti. Una velocità più bassa causerà il CD4⁺ riuscire a processo di isolamento. Lasciando la pausa impegnata diminuirà il rendimento delle celle. Utilizzare una centrifuga superiore di panca con rotori che possono essere chiusi per evitare aerosol.
8. Rimuovere il CD4 arricchito⁺ strato delle cellule dall'interfaccia utilizzando una pipetta Pasteur.
   Nota: Lo strato delle cellule arricchito sarà simile standard "buffy coat" delle cellule nuvolosa bianche, ma come solo CD4⁺ sono presenti cellule, questo naturalmente sarà più piccolo e più difficile da vedere.
9. Aggiungere 2% FBS/PBS per il CD4⁺ cellule fino ad un volume totale di 10 mL e poi lavare due volte con 2% FBS/PBS mediante centrifugazione per 10 min a 400 x g durante ogni lavaggio.
10. Risospendere il pellet in 2% FBS/PBS e contare le cellule hanno macchiato con un colorante vitale (blu di trypan) per determinare i numeri di cellulare e la vitalità.
11. Passaggio facoltativo: risospendere 5x10⁵ a 1 x 10⁶ cellule nelle medie (10% dimetilsolfossido in FBS) in aliquote di 1ml di congelamento.
    Nota: I livelli di alcuni marcatori di superficie possono essere modificati da cryo-conservazione e scongelamento. È, quindi, molto importante che tutti i campioni vengono elaborati costantemente. Al fine di ridurre al minimo le differenze nelle variabili di analisi, i campioni erano crioconservazione e raggruppati per analisi in questo studio.

2. flusso Cytometry

1. Scongelare il CD4 crioconservati⁺ cellule rapidamente in un bagno di acqua a 37 ° C e lavare una volta in mezzo pre-riscaldato (RPMI 1640 + L-Glutammina completati con 10% FBS e 1x penicillina-streptomicina).
2. Aggiungere le celle a 9 mL di medium, centrifugare per 5 min a 400 x g e rimuovere il surnatante.
3. Risospendere le cellule in 1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS (50 µ l) affinché ciascuna condizione da testare utilizza tra 5 x 10⁵ e 1 x 10⁶ cellule.
4. Mescolare le cellule con colorazione Buffer (50 µ l).
   Nota: Brillante macchia Buffer impedisce vari manufatti di macchiatura che potrebbero interferire con l'analisi dei dati, quando due o più macchie di BV o BUV vengono utilizzate contemporaneamente a causa delle proprietà chimiche intrinseche di questi coloranti. In condizioni non macchiate o singole, può essere sostituito con il 50 µ l di tampone di macchia brillante 50 µ l di 1% BSA/PBS.
5. Aggiungere gli anticorpi alle cellule (come per la colonna "volume utilizzato" nella tabella 1) e incubare in ghiaccio al buio per 30 min.
6. Lavare le cellule due volte in 1% BSA/PBS mediante centrifugazione per 3 min a 600 x g durante ogni lavaggio.
7. Risospendere in 1% BSA/PBS (400 µ l) e trasferirlo in una provetta di acquisizione di citometria a flusso.
8. Vortice le cellule delicatamente prima di acquisire dati su un citometro a flusso:

3. set-up e controlli di Cytometry di flusso

1. Utilizzando un campione senza macchia, impostare fotodiodo tensioni in modo che i linfociti possono essere separati da detriti evidenti e le cellule morte (eventi con high-side scatter (SSC) e bassa dispersione avanti (FSC) area)¹⁶. Utilizzando campioni singoli macchiati, impostare fotomoltiplicatore tensioni (PMT) affinché fluorescenza positiva può essere discernuto dalla fluorescenza di fondo mentre assicurandosi che tutti gli eventi rientrano la scala rilevabile.
   Nota: Un miglioramento sarebbe per tracciare CV contro tensione PMT per ogni PMT usando i branelli scarsamente fluorescente per trovare la tensione minima per risoluzione ottimale (il metodo "Peak 2"¹⁹).
2. Account per sovrapposizione spettrale generando una matrice di incremento retributivo usando le macchie singole con perline di cattura. Aggiungere compensazione commercialmente disponibili (60 µ l) e perline di controllo negativo (60 µ l) all'1% BSA/PBS (100 µ l) e vortice.
   Nota: Le perle di acquisizione utilizzate devono corrispondere la specie ospite e IgG isotipo dell'anticorpo utilizzato. La matrice di compensazione dovrebbe essere ricalcolata se il numero di lotto del qualsiasi tandem coloranti modifiche, come possono visualizzare una notevole variabilità nei loro spettri di emissione tra i lotti.
3. Aggiungere un singolo anticorpo (20 µ l) e vortex.
4. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 min.
5. Centrifugare a 200 x g per 10 min e scartare il surnatante.
6. Risospendere in 1%BSA/PBS (500 µ l) e mescolare nel vortex.
7. Acquisire il campione con un citometro a flusso utilizzando il generatore di matrice compensazione designato nel software acquisizione secondo le istruzioni del produttore.
8. Utilizzare i controlli FMO per indirizzare il posizionamento dei cancelli per fluorescenza marcatore positivo tenere conto per fuoriuscita di tintura sopra, che è la principale fonte di fluorescenza di fondo negli esperimenti utilizzando ≥ 4 colori¹⁶. Segui la colorazione di superficie cellulare generale protocollo come descritto nel passaggio 3, ma per ogni condizione, omettere uno dei fluorophores dalla fase di colorazione (dove CD45RA è omesso, anche omettere la macchia vive/morte). Acquisire i 100.000 linfociti per ogni condizione.
9. Impostare la positività di cancello a ≤ 0,5% delle cellule. Vedere la Figura 2 per un esempio illustrato di FMO controlli.

4. analisi dei dati

1. Impiegare acquisizione software del citometro a flusso per impostare una soglia di 5.000 unità sul parametro FSC per escludere molto piccoli detriti.
2. Utilizzare un cancello di arresto per acquisire 10.000 cellule cTfh (CD4⁺ CD45RA^– CXCR5⁺).
   Nota: Il singolo utente può raccogliere più di 10.000 cellule. Questo numero è stato un compromesso tra la raccolta abbastanza cellule per fornire risultati significativi e il tempo impiegato per la raccolta.
3. Utilizzando un'Area di FSC / SSC-Area dot trama, disegnare un ellisse o poligono cancello per selezionare la popolazione dei linfociti, pur escludendo i detriti e cellule apertamente morto (eventi con SSC-zona alta e bassa FSC-Area).
4. Utilizzando un'Area di FSC / gate trama di FSC-larghezza punto, disegnare un poligono per selezionare singole cellule escludendo doppietti (doppietti hanno un'area maggiore ma larghezza simile a cellule singole).
5. Utilizzando un'Area di FSC / CD45RA e attuabilità marcatore dot plot, disegnare un cancello rettangolare per selezionare dal vivo, CD45RA^– (cellule con una bassa fluorescenza per questo marcatore).
6. Utilizzando un'Area di FSC / CD4 dot plot, disegnare un cancello rettangolare per selezionare CD4⁺ cellule (cellule con un alta fluorescenza per questo marcatore).
7. Utilizzando un CD4 / CXCR5 dot plot, disegnare un cancello rettangolare per selezionare CXCR5⁺ (cioè cTfh) cellule (cellule con un alta fluorescenza per questo marcatore).
8. Utilizzando un CXCR3 / trama CCR6 dot, posto un quad gate di suddividere le cellule cTfh in cTfh1, 2 e 17 cellule (cellule che sono ad alta e bassa per ogni indicatore).
   Nota: Cellule con il fenotipo CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ sono poco caratterizzato. Ci riferiamo a queste cellule come cTfh1/17¹⁸ perché cellule T helper convenzionale (CD4⁺ CXCR5^–) che stanno passando tra Th17 e Th1 Visualizza espressione di CXCR3 e CCR6 e sono stati descritti come cTfh1¹⁹.
9. Utilizzare un istogramma di PD-1, utilizzare lo strumento intervallo per suddividere le cellule cTfh (o se preferite, il cTfh1 individuali, sottoinsiemi 2, 17 o 17/1) in PD-1^{-/ +} o ^Ciao popolazioni.
   Nota: La distinzione tra PD-1⁺ e PD-1^Ciao non è ben definita nella letteratura. La soglia è stata impostata come la stessa intensità di PD-1 necessaria per rilevare bona-fide Tfh nelle sospensioni del linfocita umano tonsilla mediante citometria a flusso con lo stesso pannello di anticorpi. In alternativa, un indicatore per ICOS possa aggiungersi al pannello dell'anticorpo, come solo PD1^Ciao celle sono ICOS⁺.

Risultati

Alta CD4⁺ purezza è stato raggiunto utilizzando il CD4⁺ protocollo di isolamento, che era affidabile attraverso tutti i campioni di sangue da noi testato (significa: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (Figura 3).

Identificazione di cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ cellule) in un soggetto normale rappresentativo è presentato (Figura 4A

Discussione

Questo protocollo rappresenta un modo semplice ed efficace per analizzare cTfh cellule di sangue periferico, che permette la rilevazione di tutti i sottoinsiemi rilevanti identificati nella letteratura finora. I campioni di sangue possono essere facilmente ed efficientemente ottenuti come parte di ambulatori standard e campioni di serie possa essere raccolti in parallelo con i dati clinici. A sua volta, in questo modo gli studi prospettivi valutando cTfh sottoinsiemi come biomarcatori per la progressione di malattia o di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973