CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Özet

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol⁺ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4⁺ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

Özet

Anormal T foliküler yardımcı (Tfh) hücre faaliyet otoimmün koşullarda tespit ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma lenf nodu microenvironment analiz zaman onların varlığı klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh), dolaşımdaki bellek kartı yuvası Tfh hücrelerinin kan dolaşan alt kümeleri hastalığında da tedirgin ve bu nedenle potansiyel yeni akıllı biyolojik temsil eder. Çünkü nispeten non-invaziv ve basit seri izleme sağlar periferik kan tabanlı test avantajlıdır. CD4 izole bir yöntem bu makalede⁺ T-hücreleri insan kanı ve daha fazla analiz tarafından cTfh hücreleri ve çeşitli alt grupları oranlarını numaralandırmak için akış sitometresi (cTfhPD-1^{-/ + / Merhaba}, cTfh1, 2, 17 ve cTfh1/17). Şu alt kümeleri düzeyini, normal konular ve hastalar arasında lenfoma ile karşılaştırıldı. Yöntem rutin olarak toplanan hasta malzemeden güvenilir sonuçlar elde etmek için sağlam olduğunu ortaya koymuştur. Biz analiz için tarif tekniği kolayca cep sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım uygulamaları için adapte edilebilir.

Giriş

Foliküler T yardımcı hücreleri (Tfh) olan bir CD4⁺ başlangıçta lenfoid doku¹' karakterize edildi T-hücre alt. Bu hücreler PD-1 ve CXCR5 yüzey reseptörlerinin ifade, IL-21 ve Il-4 salgılar ve transkripsiyon faktörü, BCL-6^2,3nükleer ifade gösterir. Onların adından da anlaşılacağı gibi germinal merkezleri bulunur ve yüksek afinite antikor üretim¹için gereklidir.

Dysregulated Tfh yanıt-e doğru hastalık patogenezinde, burada autoreactive B hücreleri⁴genişlemesi teşvik en önemlisi otoimmün hastalık karıştığı olmuştur. Onlar da sağlam^5,6 ve lenfoid kanserleri⁷tümör microenvironment bir rol oynamaktadır. Tersine, insan immün yetmezlik sendromları⁸indüklenebilir T-hücre costimulator (ICOS) sonucu gibi yüzey proteinleri Tfh için gerekli genetik kusurların işlev. CD4⁺ CXCR5⁺ insan periferik kan hücrelerinde foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh) dolaşan denir ve bellek kartı yuvası Tfh hücre dokuları⁹olduğuna inanılmaktadır. Burada anlatılan yöntemin amacı CD4 takip cTfh alt kümeleri analizidir⁺ hücre izolasyon periferik kan örneklerinden.

Birkaç cTfh alt kümelerini tanımlanan ve B-hücre yardım hangi ile sağladıkları verimlilik bir alt başka bir⁹' a^,10,11,12farklıdır. Şu alt kümeleri göreli oranlarını en belirgin otoimmün hastalık hangi orada olduğunu hemen hemen her zaman daha işlevsel PD-1 göreceli artış çeşitli hastalıklar, değiştirilmiş^{+/ Merhaba} ve/veya cTfh2 veya cTfh17 alt kümeleri ile karşılaştırıldığında daha az fonksiyonel PD-1^- ve/veya cTfh1 alt kümeleri¹². Sık sık bu değişiklikleri kapsamını ilişkilendirmek bir potansiyel rolünü, cTfh alt dağıtım hastalığında Tfh içinde faaliyet yansıtabilir prognostik bir biyomarker olarak belirten hastalık aktivite ve antikor titreleri dahil olmak üzere klinik parametrelerle lenfoid doku^9,12,13,14. Ayrıca, katılımcıların kan örnekleri alarak hızlı, güvenli ve kabul edilebilir ve çok hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt analizi için izleme seri sağlar.

İzole CD4 kullanımı⁺ T-hücreleri üzerinde geleneksel periferik kan mononükleer hücre (PBMNC) süspansiyonlar cTfh hücre analizi için önemli bir sayı elde etmek için gereken süreyi azaltarak daha yüksek üretilen iş akış sitometresi deneyler sağlar. Nadir cTfh alt kümeleri akışı kullanarak hücrelerden sıralama (FACS) sıralama hücre aktif hale getirildiğinde bu özellikle yararlıdır. Verimliliği yardımcı olmak için bu süspansiyonlar "örnekleri akış sitometresi deneyde kullanılacak toplu iş oluşturma özelliğinin" etkinleştirmek için cryopreserved. Sınama, CD4⁺ saflık değil dondurma tarafından düşürüldü.

CTfh hücreleri kendi keşif yöntemi erken dönemlerinde kategorize etmek için kullanılan farklı laboratuvarlar farklı işaretleri burada sunulan iki grup olarak Schmidt vd.^12, tarafından önerilen hücre yüzey işaretlerinin birleştirilmiş planı yapar kullanın eşzamanlı kimlik cTfh ve bir tek akış sitometresi içinde dokuz tanınan alt grupları etkinleştirmek için ¹⁵ deneme.

Tek hücre yüzey işaretleri kullanılan olarak hücreleri fiksasyon veya permeabilization gerekmez ve böylece aşağı akım fonksiyonel çalışmaları için hayatta kalabilir. Bu hücre FACS ile aynı antikor paneli kullanarak sıralama kolaylaştırılmış olacak. Bu panel için kullanılan akış sitometresi kısıtlamalar izin diğer işaretler, kapsayacak şekilde genişletildi.

Çok renkli akış sitometresi deneyler Analizi 2 boyutlu nokta araziler üzerinde özellikle ne zaman hücre popülasyonlarının net bı kalıcı dağıtım olarak işaret floresans içinde yok perdeleme doğal olarak öznel olması nedeniyle zor olabilir cTfh hücreleri ve alt grupları için durum. Bu nedenle, örneğin alınma olasılığını daha iyi çözünürlük etkinleştirmek için ve stratejileri güvenle geçişi ayarlamak için el eşyaları azaltmak için etkili denetimleri ayarlama zorunludur. Bu nedenle, antikor panel tasarım ve temel akış sitometresi denetimlerinde up, yani, değerinin kullanılması deneme ve FMO denetimleri özetlenen adım 3.4.2 ve 3.4.3,respectively.

Tüm cTfh hücreleri CD4 tanımlanan⁺ CXCR5⁺ CD45RA^-. Alt kümelerine PD-1^-, PD-1⁺ veya PD-1^Merhaba cTfh hücreleri tanımlamak için ifade karakteristik Tfh harekete geçirmek işaretin PD-1 düzeyde sonra belirlenir. O zaman, kemokin reseptörleri CXCR3 ve CCR6 bir arada kullanarak, hangi differentially ifade tarafından geleneksel Th1, 2 ya da 17 hücreleri, cTfh cTfh1, 2-17 gibi CXCR3 bir profil tarafından olarak karakterize edilebilir⁺ CCR6^-, CXCR3^- CCR6^- ve CXCR3^- CCR6⁺, anılan sıraya göre.

Bizim laboratuvar tarafından kullanılan antikor paneli Tablo 1' de görüntülenir. Kullanıcı lazer ve ışık filtresi yapılandırması için kendi yerel akış sitometresi kullanılabilir hesap için kendi fluorophore seçimi adapte olabilir.

Aşağıdaki önemli noktalar fluorophores seçimi etkiler. Parlak fluorophores mümkün olduğunda kullanın. Özellikle, en parlak kullanılabilir fluorophores üzerinde dimmest (daha az yüksek ifade) işaretleri kullanın. PD-1, CXCR3 ve CCR6, dimmer işaretleri içerir ve daha az bir ölçüde, CXCR5. Özellikle yeni BB, BV ve BUV kullanmak yapılmış mükemmel parlaklık sağlamak ve böylece hücrelerin farklı nüfusun daha kolay çözünürlüğünü etkinleştirmek fluorophores.

Fluorophore seçim spektral örtüşme ve böylece gerekli tazminat düzeyini en aza indirmek mümkün olduğu kadar emisyon spectra arasında yayıldı. Akış Sitometresi Bölmesi tasarlamaya yardımcı olmak için kullanılan ücretsiz, online alet-ebilmek bulunmak burada: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Emisyon spektrumda yer kazanmak için bir "döküm kanal" ikisi de öldü algılama (ve dışlanma) etkinleştirmek için bu APC-H7 (CD45RA için Birleşik) ile örtüşen bir emisyon dalga boyu ile bir canlılık boya kullanarak çalıştırmaya başladık ve/veya CD45RA⁺ kullanarak bir tek dedektör.

Burada, bir protokol yalıtım⁺ T-hücrelerinin periferik kan CD4 ve onların daha sonraki analiz için farklı ve son zamanlarda açıklanan alt kümeleri dolaşan oranlarını belirlemek için akış sitometresi tarafından sunulur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Kan örnekleri normal bir konu (NS) elde (n = 12) yanı sıra marjinal zon Lenfoma (MZL) olan hastalar (n = 7) ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma (BNHL) (6 FL hastalar, 2 lymphoplasmacytic lenfoma hastaları ve 1 düşük dereceli B-hücre diğer türleri Non-Hodgkin's lenfoma değil Aksi takdirde hasta belirtilen). Sonra verilen bilgili, tüm çalışmaları için yerinde etik onayı ile yazılı izni hastalar Leicester Royal revir, Hematoloji Kliniği gelen işe. Etik onay Leicestershire, Northamptonshire ve Rutland Araştırma Etik Komitesi 1 ' başvuru 06/Q2501/122 hasta örnekleri ve sağlık araştırma yetkilisi (HRA) NRES Komitesi East Midlands-Derby tarafından elde edildi, 14/EM/1176 için referans normal konular.

1. yalıtım CD4⁺ T-tüm ikincil kan hücrelerinden

1. Taze kan periferik (2-15 mL) K₂EDTA tüpler içine almak standart iz ve en kısa zamanda en büyük canlılık korumak için işlem.
   Not: Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipman (ceket, eldiven, gözlük) kullanın ve bir sınıf II Biyogüvenlik kabini çalışmalarında yürütmek.
2. Kan ve tüm gerekli kimyasalları getirmek (CD4⁺ zenginleştirme kokteyl, % 2 fetal Sığır serum/tamponlanmış fosfat serum (FBS/PBS), yoğunluğu degrade medya ve hücreleri cryopreserving Eğer donma orta) Oda sıcaklığında için.
3. Mix kan antikorlar insan CD4 zenginleştirme için piyasada bulunan bir kokteyl ile⁺ T hücreleri. Reaktif 50 µL kan her 1 mL-için kullanın. 50 mL konik polipropilen boru için 5 ila 15 mL kan kullanın.
   Not: 2-4 mL kan kullanıyorsanız, bu adımı bir 14 mL konik Polipropilen tüp içinde gerçekleştirin.
4. Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
5. Karışımı eşit bir birimdeki % 2 oranında seyreltin FBS/PBS
6. Yavaş yavaş arabirimi rahatsız edici önlemek ve hemen yoğunluk gradient orta içine kan difüzyon önlemek için Santrifüjü geçin yoğunluğu degrade medya üstüne seyreltilmiş bu karışımı katman.
   1. 2-3 mL kan yoğunluk gradient orta 3 mL 14 mL konik polipropilen boru, ancak 4 mL kan kullanımının, yoğunluk gradient orta 4 mL 14 mL konik polipropilen boru ve 5-15 mL kan için kullanın , yoğunluk gradient orta 15 mL 50 mL konik polipropilen boru içinde kullanın.
7. 1200 x g de 20 dk için katmanlı karışımı ile fren off 20 ° C'de santrifüj kapasitesi
   Not: Altındaki ortam sıcaklık kırmızı kan hücreleri ve granülosit ile kirlenme neden olabilir. Daha düşük bir hız CD4 neden olur⁺ yalıtım işleminin başarısız olmasına. Nişanlı sonu bırakarak hücre verim azalır. Bir tezgah üst santrifüj aerosoller önlemek için kapalı rotorlar ile kullanın.
8. Zenginleştirilmiş CD4 kaldırmak⁺ hücre katmanı Pasteur pipet kullanarak arabirim üzerinden.
   Not: Zenginleştirilmiş hücre katmanı bir standart "buffy kat" beyaz bulutlu hücre ama sadece CD4 olarak benzer⁺ hücreleri mevcut, bu doğal olarak daha küçük ve daha zor görmek için olacak.
9. % 2 eklemek FBS / CD4 PBS'ye⁺ hücreleri toplam hacmi 10 mL ve % 2 ile iki kez daha sonra yıkama kadar 10 dk 400 x g de her yıkama sırasında centrifuging tarafından FBS/PBS.
10. Pelet % 2 resuspend FBS/PBS ve sayısı hücreleri hücre sayıları ve canlılığı belirlemek için bir hayati boya ile (trypan mavi) lekeli.
11. İsteğe bağlı adım: 5 x 10⁵ 1 mL aliquots (FBS % 10 dimetil sülfoksit) ortamda dondurma 1 x 10⁶ hücrelere resuspend.
    Not: Düzeyleri bazı yüzey işaretlerinin cryo-koruma ve çözme tarafından değişmiş olabilir. Bu nedenle, olan çok önemli tüm örneklerini sürekli olarak işlenir. Analitik değişkenleri farklılıkları en aza indirmek için örnekleri cryo korunmuş ve analiz bu çalışmada için toplanmış.

2. akış sitometresi

1. Cryopreserved CD4 çözülme⁺ hücreleri hızlı bir şekilde 37 ° C ve yıkama bir kez içinde önceden ısıtılmış orta (RPMI 1640 + L-glutamin %10 FBS ve 1 x penisilin-streptomisin) adlı bir su banyosunda.
2. Orta, santrifüj 400 x g de 5 min için 9 mL hücreleri eklemek ve süpernatant kaldırın.
3. PBS içinde % 1 sığır serum albümin (BSA) hücrelerde resuspend (50 µL) her koşulu test edilmesi için kullanır, böylece 5 x 10⁵ ve 1 x 10⁶ hücreler arasında.
4. Hücreleri boyama arabellek ile karıştırın (50 µL).
   Not: İki veya daha fazla BV veya BUV lekeleri bu boyalar doğal kimyasal özellikleri sayesinde aynı anda kullanıldığında bu veri analizi ile girişime neden olabilir çeşitli boyama eserler parlak leke arabellek engel olur. Tek veya günahı koşullarda parlak leke arabellek 50 µL % 1 50 µL için yedek olabilir BSA/PBS.
5. Antikorlar hücreleri (göre "kullanılan birim" sütun içinde tablo 1) ekleyin ve buz 30 dk için karanlıkta kuluçkaya.
6. % 1'i iki kez hücrelerde yıkamak için 600 x g de 3 dk her yıkama sırasında centrifuging tarafından BSA/PBS.
7. % 1'resuspend BSA/PBS (400 µL) ve bir akış sitometresi edinme tüp aktarmak.
8. Girdap yavaşça bir akış sitometresi verileri alınıyor önce hücreleri:

3. akış sitometresi denetimleri ve kurulum

1. Günahı bir örnek kullanarak, fotodiyot gerilimleri lenfositler bariz enkaz ve ölü hücreleri (yüksek dağılım (SSC) ve düşük ileri dağılım (FSC) alan olayları)¹⁶ayrılmış şekilde ayarlayın. Pozitif floresans gelen tüm olayların içinde tespit ölçekli Güz emin yaparken arka plan floresans ayırt edilebilir tek kullanarak örnekleri, lekeli photomultiplier (PMT) gerilimleri ayarlayın.
   Not: En düşük voltaj optimum çözünürlük ("Zirve 2" yöntemi¹⁹) bulmak için loş floresan boncuk kullanarak her Devresel_ödeme için Devresel_ödeme gerilim karşı CV çizilecek bir gelişme olur.
2. Hesap yakalama boncuk ile tek lekeler kullanarak tazminat matris oluşturarak spektral örtüşme. Piyasada bulunan tazminat boncuk (60 µL) ve negatif kontrol boncuk (60 µL) % 1'e Ekle BSA/PBS (100 µL) ve girdap.
   Not: Kullanılan yakalama boncuk ana türler ve kullanılan antikor IgG izotip eşleşmesi gerekir. Herhangi bir tandem çok sayıda değişiklikleri, boya Eğer onlar kendi emisyon spectra arasında çok önemli ölçüde değişkenlik görüntüleyebilirsiniz tazminat matris yeniden hesaplanan olmalı.
3. Bir tek antikor (20 µL) ve girdap ekleyin.
4. 30 dk için karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.
5. Vasıl 200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
6. 1%BSA/PBS içinde resuspend (500 µL) ve girdap.
7. Örnek bir akış sitometresi edinme yazılım üretici yönergelerine göre belirlenen tazminat matris jeneratör kullanarak elde.
8. Arka plan floresans deneylerde ≥4 Renkler¹⁶kullanarak ana kaynağı olan, boya dökülür hesaba olumlu işaret floresans geçitlerini yerleştirme kılavuzunu FMO denetimleri kullan. Adım 3'deki ama her koşul için açıklandığı gibi protokol genel hücre yüzey boyama takip atlayın bir boyama adım fluorophores (CD45RA atlanmış yerde, aynı zamanda canlı/ölü leke atın). Her koşul için 100.000 lenfositler elde etmek.
9. Kapı pozitif hücrelerinin ≤0.5% ayarlamak. Şekil 2 resimli FMO denetimleri örneği için bkz.

4. veri analizi

1. Akış Sitometresi'nın satın alma yazılım bir eşik 5000 Birim çok küçük enkaz dışlamak için FSC parametresini ayarlamak için kullanır.
2. 10.000 cTfh hücreleri elde etmek için bir durdurma kapı kullanmak (CD4⁺ CD45RA^- CXCR5⁺).
   Not: Bireysel kullanıcı 10.000'den fazla hücreleri toplar. Bu numara anlamlı sonuçlar ve koleksiyon için geçen süre sağlamak için yeterince hücre toplama arasında bir uzlaşma oldu.
3. FSC alanõ kullanarak / SSC-alan nokta arsa, enkaz hariç ederken lenfositler nüfusu seçmek için bir elips veya Çokgen kapı çizmek ve açıktan açığa ölü hücreleri (olayları bir yüksek SSC-alanı ve düşük FSC-alan).
4. FSC alanõ kullanarak / FSC-genişlik nokta arsa, Çiz Çokgen bir kapı ise (birini var ama benzer genişliği artan bir alan tek hücrelere) birini hariç tek hücreleri seçmek için.
5. FSC alanõ kullanarak / CD45RA ve canlılığı marker nokta arsa, canlı, CD45RA seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek^- hücreleri (Bu işaretçi için düşük bir floresan hücreleri).
6. FSC alanõ kullanarak / CD4 nokta arsa, CD4 seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek⁺ hücreleri (Bu işaretçi için yüksek bir floresan hücreleri).
7. Bir CD4 kullanarak / CXCR5 nokta arsa, CXCR5 seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek⁺ (yani cTfh) hücreleri (Bu işaretçi için yüksek bir floresan hücreleri).
8. Bir CXCR3 kullanarak / CCR6 nokta arsa, dört bir kapı cTfh hücre cTfh1, daha alt bölümlere ayırma 2 ve 17 hücreler (her işaretçisi için yüksek ve düşük olan hücreleri).
   Not: Hücreleri CD4 fenotip ile⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ ile karakterize olan kötü. Biz çünkü cTfh1/17¹⁸ bu hücrelere başvuran geleneksel yardımcı T hücreleri (CD4⁺ CXCR5^-) bu CXCR3 Th1 ve Th17 Haritayı ifade ve CCR6 arasında geçiş ve cTfh1/17¹⁹tarif edilmiştir.
9. PD-1 çubuk grafik kullanarak cTfh hücreleri daha alt bölümlere ayırma aralığı aracı kullanmak (veya tercih edilen, bireysel cTfh1 2, 17 veya 1/17 alt kümeleri) PD-1 içine^{-/ +} veya ^Merhaba nüfus.
   Not: PD-1⁺ ve PD-1^Merhaba arasında ayrım literatürde iyi tanımlanmış değildir. Eşik bona fide Tfh akış sitometresi ile aynı antikor panelini kullanarak tonsil insan lenfosit süspansiyonlar algılamak için gereken aynı PD-1 yoğunluk olarak kuruldu. Alternatif olarak, yalnızca PD1^Merhaba hücreleri ICOS⁺olduğu gibi ICOS için bir işaretleyici antikor paneline eklenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yüksek CD4⁺ saflık elde CD4 kullanarak⁺ tüm kan örnekleri arasında güvenilir yalıtım Protokolü tarafımızca test (yani: %96.6, SD: 2.38, n = 31) (Şekil 3).

CTfh tanımlaması (CD4⁺ CXCR5⁺ hücreleri) konuda normal bir temsilcisi olan (Şekil 4A) sunulmaktadır. Toplam cTfh hücreleri CD4 içinde ora...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı periferik kan cTfh hücreleri, literatürde şimdiye kadar tanımlanan tüm ilgili alt kümeleri algılanmasını sağlayan analiz etmek için basit ve verimli bir şekilde temsil eder. Standart out-hasta klinikler ve seri örnekleri parçası klinik veri ile paralel olarak toplanabilir gibi kan örneklerini kolayca ve verimli bir şekilde elde edilebilir. Buna karşılık, bu prospektif çalışmalar hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt için biyolojik olarak cTfh alt kümeleri değerlendirmek sa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973