בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

Summary

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול⁺ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4⁺ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

Abstract

חריגה הזקיקים-T helper (Tfh) תא לזיהוי של מחלות אוטואימוניות ולא נוכחותם קשורה עם התוצאות הקליניות כאשר הצומת לימפה microenvironment ב B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של ניתוח. קבוצות משנה של מחזורי T-helper תאי (cTfh), תא זיכרון מחזורי Tfh תאים בדם, הם גם מוטרד במחלה, לפיכך מייצגות פוטנציאל סמנים ביולוגיים חזוי הרומן. בדיקות מבוססות-דם היקפיים היא יתרון כי היא יחסית לא פולשנית, מאפשר ניטור טורי פשוטה. מאמר זה מתאר שיטה אנליטית CD4⁺ תאי T-דם אנושי, ולאחר ניתוח נוסף מאת cytometry זרימה לספור תאים cTfh, את הפרופורציות של קבוצות משנה שונים שלהם (cTfhPD-1^{-/ + / שלום}, cTfh1, 2, 17 ו- cTfh1/17). הרמה של קבוצות משנה אלה השוו בין נושאים נורמליים, חולים עם לימפומה. מצאנו כי שיטת הפעולה היתה יציבה מספיק כדי להשיג תוצאות אמינות של החומר המטופל שנאספו באופן שגרתי. הטכניקה שנתאר לניתוח ניתן להתאים בקלות מיון תא ויישומים במורד הזרם כגון RT-PCR.

Introduction

T-helper תאי (Tfh) הם CD4⁺ משנה T-cell שאפיינו היה בתחילה רקמות הלימפה¹. תאים אלה מביעים PD-1 קולטנים משטח CXCR5, מפרישים IL-21 ו- IL-4 ולהראות ביטוי הגרעין של הגורם שעתוק, BCL-6^2,3. כפי שמרמז שמם, הם נמצאים במרכזים נבטי, הם חיוניים עבור ייצור נוגדנים זיקה גבוהה¹.

תגובות Dysregulated Tfh היו מעורבים בפתוגנזה מחלה, מחלות אוטואימוניות שהבולט, איפה הם מקדמים את התרחבות autoreactive B תאים⁴. הם גם לשחק תפקיד microenvironment הגידול של סרטן הלימפה⁷והן מוצק^5,6 . לעומת זאת, פגמים גנטיים של חלבונים פני שטח חיוני Tfh לתפקד כמו התוצאה costimulator (ICOS) T-cell inducible הכשל החיסוני האנושי תסמונות⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ בתאי דם היקפיים אדם מכונים במחזור T-helper תאי (cTfh), מאמינים כי תא זיכרון Tfh תאים ברקמות⁹. מטרת השיטה המתוארת כאן היא הניתוח של קבוצות משנה cTfh בעקבות CD4⁺ תא בידוד של דגימות דם היקפיים.

מספר קבוצות משנה cTfh הוגדרו, היעילות שבה הם מספקים עזרה B-cell שונה משנה אחת עוד^9,10,11,12. כמויות יחסיות של קבוצות משנה אלה שונו במספר מחלות, לרוב בצורה בולטת מחלות אוטואימוניות שבו שם הוא כמעט תמיד עלייה יחסית יותר פונקציונלי PD-1^{/ היי} ו/או קבוצות משנה cTfh2 או cTfh17, לעומת הפחות משטרת פונקציונלי-^– 1 ו/או קבוצות משנה cTfh1¹². היקף השינויים הללו לעתים קרובות לשייך פרמטרים קליניים, כולל מחלת titers פעילות של נוגדן עצמי, המעידים על תפקיד אפשרי של התפלגות משנה cTfh כמו סמן prognostic במחלה, אשר עשוי לשקף את הפעילות של Tfh ב רקמות הלימפה^9,12,13,14. בנוסף, לקחת דגימות דם המשתתפים זו קביל, מהירה ובטוחה, ומאפשר אז טורי ניטור לניתוח של התקדמות המחלה או תגובה לטיפול.

השימוש של CD4 מבודד⁺ תאי-T על המתלים תאי תא (PBMNC) המסורתית דם היקפיים מאפשר גבוה יותר תפוקה לזרום cytometry ניסויים על-ידי צמצום הזמן הנדרש כדי לרכוש מספר ניכר של תאים cTfh לניתוח. אפשרות זו שימושית במיוחד בעת מיון תאים cTfh נדיר קבוצות משנה באמצעות זרימת הפעלת התא מיון (FACS). לסייע את היעילות, תרחיפים אלה יכול להיות cryopreserved כדי לאפשר "אצווה" של דגימות ייעשה הניסוי cytometry זרימה. על בדיקות, CD4 את⁺ טוהר לא נוכה הקפאה קריוגנית.

בעוד מעבדות שונות נעשה שימוש סמנים שונים כדי סיווג חלוקה לקטגוריות cTfh תאים בשלבים המוקדמים של גילוין, השיטה המוצגת כאן עושה שימוש ערכה אחידה של שתי קבוצות של תאים-פני סמני כפי שהוצע על ידי שמידט ואח^{12, 15} כדי לאפשר זיהוי סימולטני cTfh ו שלהם קבוצות משנה מוכרת תשע ב cytometry זרימה יחיד הניסוי.

היחידה סמני פני שטח התא משמשים, התאים אינם מצריכים קיבוע או permeabilization, ולכן יכול להישאר בחיים ללימודי פונקציונלי במורד הזרם. זה יכול להיות בהנחייתם של התא מיון באמצעות FACS באותו פאנל נוגדן. לוח זה יכול להיות מורחבת לכלול סמנים אחרים, ומאפשר ההגבלות של cytometer זרימת בשימוש.

הניתוח של ניסויים cytometry זרימה צבע רב יכול להיות מאתגר בשל אופיו מטבעם סובייקטיביות של gating על נקודה 2-ממדי חלקות, במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים שאין התפלגות ברורה bi-מודאלי סמן פלורסצנטיות, כמו גם במקרה של תאים cTfh, קבוצות משנה שלהם. מסיבה זו, זה הכרחי כדי להגדיר את הפקדים יעיל כדי להפחית את חפצי אמנות כדי לאפשר רזולוציה טובה יותר של אוכלוסיות וכדי להגדיר gating אסטרטגיות בביטחון. ככזה, עיצוב לוח נוגדן, את הסידור של פקדים בסיסיים עבור cytometry זרימה הניסוי, קרי, באמצעות פיצוי, FMO הפקדים יוקפו בקו שלב 3.4.2 ועל 3.4.3,respectively.

כל התאים cTfh מוגדרים CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. ניתן לקבוע את רמת הביטוי של דה מרקר הפעלה האופיינית Tfh PD-1 ואז לזהות תת-קבוצות של PD-1^-, PD-1⁺ או PD-1^היי cTfh תאים. לאחר מכן, באמצעות שילוב של קולטני כימוקין CXCR3 ו CCR6, אשר מתבטאים באופן שונה על ידי Th1 מסורתיים, 2 או 17 תאים, cTfh שניתן לאפיין cTfh1, 2 או דמוי-17 על ידי פרופיל של CXCR3⁺ CCR6^-, CXCR3^– CCR6^- , ו CXCR3^– CCR6⁺, בהתאמה.

לוח הנוגדן בשימוש על ידי המעבדה שלנו מוצג בטבלה1. המשתמש, ייתכן שיהיה עליך להתאים את הבחירה שלהם fluorophore לקחת בחשבון הלייזר ואת תצורת המסנן קלות זמינים על cytometer זרימה המקומי שלהם.

השיקולים הבאים להשפיע על בחירתו של fluorophores. השתמש fluorophores בהיר במידת האפשר. בפרט, להשתמש fluorophores זמין המבריקים של הסמנים (ביטוי פחות מאוד) dimmest. סמני דימר כוללים PD-1, CXCR3, CCR6, וכדי במידה פחותה CXCR5. אנחנו ספציפית הפך השימוש החדשים BB, BV, שתקנה לעצמך fluorophores אשר לספק בהירות מצוינת, ובכך לאפשר פתרון קל יותר של אוכלוסיות שונות של תאי.

מורחים את הבחירה fluorophore על פני ספקטרום פליטה ככל האפשר למזער חפיפה ספקטרלי וכך רמת הפיצוי הנדרש. כלי מקוון חינם, ניתן להשתמש כדי לסייע בתכנון לוח cytometry זרימה ניתן למצוא כאן: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. כדי לחסוך מקום על ספקטרום הפליטה, אנחנו מועסקים "ערוץ ה-dump" באמצעות צבע הכדאיות עם אורך גל פליטה החופפים עם זה של APC-H7 (מצומדת כדי CD45RA) כדי לאפשר את איתור (להדרה) של שניהם מתים ו/או CD45RA⁺ שימוש גלאי יחיד.

. הנה, פרוטוקול מוצג הבידוד של דם היקפיים CD4⁺ תאי-T וניתוח עוקבות שלהם על-ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של שונות, תיאר לאחרונה במחזור קבוצות משנה.

Protocol

דגימות דם, התקבלו נושאים נורמליים (NS) (n = 12) כמו גם בחולים עם לימפומה אזור שוליים (MZL) (n = 7) ובסוגים אחרים של B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של (BNHL) (פל 6 חולים, חולי לימפומה lymphoplasmacytic 2 ו 1 בדרגה נמוכה B-cell לימפומה הודג'קין לא צוין אחרת החולה). חולים גויסו מן המרפאות המטולוגיה-במרפאה המלכותית לסטר לאחר בנתינתו הודיעו, הסכמה בכתב, באישור אתית במקום עבור כל מחקרים. אישור מוסרי היה מתקבל על ידי לאיססטרשיר, נורת'האמפטונשייר ראטלנד מחקר אתיקה הוועדה 1, התייחסות 06/Q2501/122 רשות המחקר תקינות (HRA) NRES ועדת מזרח המידלנדס-הדרבי ודוגמאות החולה, הפניה 14/EM/1176 עבור נושאים נורמליים.

1. בידוד של CD4⁺ T-תאים מדם היקפי לגמרי

1. לקחת דם היקפיים טרי (2-15 מ"ל) K₂EDTA צינורות מאת venipuncture רגיל ותהליך בהקדם האפשרי כדי לשמור על יכולת הקיום המרבי.
   הערה: לשימוש מעבדה סטנדרטיים ציוד מגן אישי (מעיל, כפפות, משקפיים) ולבצע את העבודה בכיתה II אבטחה הקבינט.
2. להביא את הדם, ריאגנטים נחוץ כל (CD4⁺ העשרה קוקטייל, 2% עוברית שור סרום/פוספט buffered תמיסת מלח (FBS/PBS), מדיה הדרגתיות צפיפות ומקפיא בינונית אם cryopreserving תאים) לטמפרטורת החדר.
3. לערבב את הדם עם קוקטייל זמינים מסחרית של נוגדנים עבור העשרת של CD4 האנושי⁺ תאי T. השתמש µL 50 מהתרכובת עבור כל 1 מ"ל של דם. השתמש צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל 5-15 מ של דם.
   הערה: אם משתמש 2-4 מ"ל של דם, לבצע שלב זה צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ.
4. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
5. לדלל את התערובת עם אמצעי אחסון שווה 2% FBS/PBS
6. שכבה זו תערובת מדולל על המדיה הדרגתי של צפיפות לאט כדי להימנע מהפרעה הממשק והמשך צנטריפוגה מיד כדי למנוע דיפוזיה של הדם לתוך המדיום הדרגתיות צפיפות.
   1. עבור 2-3 מ"ל של דם, להשתמש 3 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ"ל, אך עבור 4 מ"ל של דם, להשתמש 4 מ של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ"ל, 5-15 מ"ל דם , להשתמש 15 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל.
7. Centrifuge התערובת שכבתית עבור 20 דקות ב x 1200 גרם עם הבלמים ב 20 º C.
   הערה: טמפרטורה מתחת לממוצע עלול לגרום לזיהום עם כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים. מהירות נמוכה יותר יגרום CD4 את⁺ בתהליך בידוד להיכשל. עוזב את הפסקה העוסקת יקטן תא התשואה. השתמש צנטריפוגה העליון ספסל עם רוטורים כי ניתן לסגור כדי להימנע אירוסולים.
8. הסר את CD4 מועשר⁺ שכבת תאים מממשק באמצעות פיפטה של פסטר.
   הערה: השכבה תא מועשר ידמה תקן "המעיל באפי" של תאים לבנים מעוננים, אלא רק CD4⁺ תאים קיימים, זה כמובן יהיה קטן יותר, קשה יותר לראות.
9. להוסיף 2% FBS/PBS כדי CD4⁺ תאים עד הנפח הכולל של 10 מ"ל, ואז לשטוף פעמיים עם 2% FBS/PBS מאת צריך שתוציאו 10 דקות ב x 400 גרם במהלך כל כביסה.
10. Resuspend בגדר ב 2% FBS/PBS, ספירת התאים צבעונית עם צבע חיוני (trypan blue) כדי לקבוע את מספרי הטלפון הנייד ואת הכדאיות.
11. שלב אופציונלי: resuspend 5 x 10⁵ עונה 1 פרק 10 תאים⁶ קפואים בינוני (10% דימתיל סולפוקסיד ב FBS) aliquots 1 מ"ל.
    הערה: רמות של כמה סימונים משטח עשוי להשתנות על ידי שימור-הקפאה והפשרה. זה, לכן, חשוב מאוד כי כל דוגמאות מעובדות בצורה עיקבית. כדי למזער את הבדלי במשתני אנליטית, הדגימות היו הקפאה- משומרים אצווה עבור ניתוח במחקר זה.

2. דנ

1. להפשיר את CD4 cryopreserved⁺ תאים במהירות בתוך אמבט מים 37 ° C ו לשטוף פעם בכמה מראש ומחוממת בינוניים (RPMI 1640 + -גלוטמין בתוספת 10% FBS ו 1 x פניצילין-סטרפטומיצין).
2. להוסיף את התאים 9 מ של מדיום, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
3. Resuspend תאי 1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS (50 µL) כך כל תנאי להיבדק משתמשת בין 5 x 10⁵ עונה 1 פרק 10⁶ תאים.
4. מערבבים את התאים עם מאגר מכתים (50 µL).
   הערה: מאגר כתם מבריק מונע חפצי מכתימים שונות שעלולות לפגוע ניתוח נתונים כאשר שניים או יותר BV או שתקנה לעצמך כתמי משמשים בו זמנית עקב הטבועה את התכונות הכימיות של צבעים אלה. בתנאים יחיד או מוכתם, µL 50 כתם מבריק מאגר הרבה מכדי µL 50% 1 BSA/PBS.
5. להוסיף את הנוגדנים לתאים (לפי "אחסון בו נעשה שימוש" טור ב טבלה 1), דגירה על קרח בחושך למשך 30 דקות.
6. לשטוף את התאים פעמיים ב 1% BSA/PBS מאת צריך שתוציאו למשך 3 דקות ב x 600 גרם במהלך כל כביסה.
7. Resuspend 1% BSA/PBS (400 µL), העברת צינור רכישה של cytometry זרימה.
8. מערבולת התאים בעדינות לפני רכישת על cytometer זרימת נתונים:

3. לזרום Cytometry פקדים והתקנה

1. באמצעות דוגמה וללא רבב, להגדיר את המתחים פוטודיודה כך לימפוציטים ניתן להפריד פסולת ברור, תאים מתים (אירועים עם צד גבוהה פיזור (האס) אזור ואזור פיזור קדמי נמוך (FSC))¹⁶. באמצעות דגימות מוכתם יחיד, להגדיר האופטיקה המתחים (PMT) כך פלורסצנטיות חיובי מבחינים מן הרקע פלורסצנטיות תוך הקפדה כי כל האירועים למניית בסולם לזיהוי.
   הערה: שיפור יהיה מגרש של קורות חיים נגד מתח PMT בכל PMT באמצעות חרוזים במעומעם פלורסנט כדי למצוא את המתח המינימלי לפתרון האופטימלי ("שיא 2" שיטת¹⁹).
2. חשבון עבור ספקטרלי חפיפה על ידי יצירת מטריצה פיצוי באמצעות כתמים יחיד עם לכידת חרוזים. להוסיף חרוזים פיצוי זמינים מסחרית (60 µL), וחרוזים בקרה שלילית (60 µL) 1% BSA/PBS (100 µL), ו מערבולת.
   הערה: החרוזים ללכוד להשתמש להתאים את המארח מינים ו IgG isotype של הנוגדן בשימוש. המטריקס הפיצוי צריך להיות מחושב מחדש אם המספר הרבה של כל טנדם צבענים שינויים, כפי הם יכולים להציג את השתנות ניכר ב ספקטרום הפליטה שלהם בין מגרשים.
3. להוסיף נוגדן בודד (20 µL) ו מערבולת.
4. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
5. צנטריפוגה ב x 200 גר' 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
6. Resuspend, 1%BSA/PBS (500 µL) ו מערבולת.
7. רוכשים את הדגימה עם cytometer זרימה באמצעות הגנרטור מטריקס פיצוי המיועד לכך בתוכנה רכישה בהתאם להוראות היצרן.
8. השתמש בפקדים FMO להנחות את המיקום של השערים עבור קרינה פלואורסצנטית סמן חיובי עבור לשפוך צבע, אשר הוא המקור העיקרי של רקע זריחה בניסויים באמצעות צבעים ≥4¹⁶. בצע ההכתמה תא-פני כללי הפרוטוקול כפי שמתואר בשלב 3, אבל עבור כל תנאי, להשמיט אחד fluorophores מהשלב מכתימים (היכן CD45RA מושמט, גם להשמיט את הכתם חי/מת). רוכשים לימפוציטים 100,000 עבור כל תנאי.
9. להגדיר את הגישה החיובית שער ב- % ≤0.5 של תאים. ראה איור 2 לדוגמא מאויר של פקדים FMO.

4. ניתוח נתונים

1. מעסיקים רכישת תוכנה של cytometer זרימה כדי לקבוע סף של 5,000 יחידות על הפרמטר FSC להוציא פסולת קטן מאוד.
2. השתמש שער עוצר כדי להשיג 10,000 תאים cTfh (CD4⁺ CD45RA^– CXCR5⁺).
   הערה: המשתמש הבודד יכול לאסוף יותר מ-10,000 תאי. מספר זה היה פשרה בין איסוף מספיק תאים לספק תוצאה משמעותית את משך הזמן לאוסף.
3. באמצעות FSC-אזור / מגרש נקודה האס-אזור, לצייר דרך שער אליפסה או מצולע כדי לבחור את אוכלוסיית לימפוציטים בזמן למעט פסולת, בגלוי מת תאים (אירועים עם האס גבוהה-אזור ואזור נמוך FSC-).
4. באמצעות FSC-אזור FSC ברוחב נקודה העלילה, צייר מצולע שער כדי לבחור תאים בודדים שיתופם של doublets (doublets יש אזור מוגברת אבל רוחב דומים לתאים בודדים).
5. באמצעות FSC-אזור / סמן CD45RA ואת הכדאיות לנקד העלילה, לצייר שער מלבני כדי לבחור לחיות, CD45RA תאים^– (תאים עם פלורסצנטיות נמוך עבור סמן זה).
6. באמצעות FSC-אזור / CD4 לנקד העלילה, לצייר שער מלבני לבחירת CD4⁺ תאים (תאים עם פלורסצנטיות גבוהה עבור סמן זה).
7. שימוש של CD4 / CXCR5 נקודה העלילה, לצייר שער מלבני לבחירת CXCR5⁺ (קרי cTfh) תאים (תאים עם פלורסצנטיות גבוהה עבור סמן זה).
8. באמצעות CXCR3 של CCR6 נקודה העלילה, לפני ארבע ליבות שער משנית cTfh תאים לתוך cTfh1, תאים 2 ו- 17 (תאים שנמצאים גבוה ונמוך עבור כל סמן).
   הערה: תאים בעלי פנוטיפ CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ הן מאופיינות היטב. אנחנו מתייחסים לתאים אלו cTfh1/17¹⁸ כי המסייע קונבנציונאלי תאי-T (CD4⁺ CXCR5^–) זה עושים מעבר מיגדרי בין Th17 ו- Th1 הצג ביטוי של CXCR3 CCR6, תוארו cTfh1/17¹⁹.
9. באמצעות היסטוגרמה PD-1, השתמש בכלי טווח משנית תאים cTfh (או אם מועדף, cTfh1 בודדים, קבוצות משנה 2, 17 או 1/17) לתוך PD-1^{-/ +} או אוכלוסיות ^שלום .
   הערה: ההבחנה בין PD-1⁺ ו- PD-1^היי אינה מוגדרת היטב בספרות. הסף נקבע כמו באותה אינטנסיביות PD-1 הדרוש לאיתור תמת-Tfh ב השעיות לימפוציט שקדים האנושי באמצעות cytometry זרימה עם נוגדן באותו הפאנל. לחלופין, ניתן להוסיף סמן ICOS ללוח נוגדן, כפי PD1^שלום תאים ICOS⁺.

תוצאות

CD4 גבוהה⁺ טוהר הושג באמצעות CD4 את⁺ בידוד פרוטוקול, אשר היה אמין בכל הדוגמאות הדם נבדק על ידינו (כלומר: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (איור 3).

זיהוי של cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ תאים) בנושא נורמלי נציג מוצג (איור 4א

Discussion

פרוטוקול זה מייצג דרך פשוטה ויעילה כדי לנתח את היקפי cTfh כדוריות הדם, המאפשר הזיהוי של כל קבוצות משנה רלוונטיים שזוהו עד כה בספרות. דגימות דם ניתן בקלות וביעילות להשיג כפי ניתן לאסוף חלק סטנדרטי-חולה מרפאות ודוגמאות טורי במקביל נתונים קליניים. בתורו, פעולה זו מאפשרת מחקרים להערכת ערכות משנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973