Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Resumen

Aquí, un protocolo para el aislamiento y la caracterización de CD4⁺ T-cell se describe subconjuntos de sangre periférica humana. Purificada de CD4⁺ las células T son analizadas por citometría de flujo para determinar proporciones de subconjuntos de células helper T-folicular.

Resumen

Actividad folicular T aberrante de las células helper (Tfh) es detectable en condiciones autoinmunes y su presencia se asocia con resultados clínicos cuando se analiza el microambiente del nodo de linfa en el linfoma no Hodgkin de células B. Subconjuntos de linfocitos T-folicular (cTfh), el compartimiento de memoria circulantes de Tfh células en la sangre en circulación son también perturbados en la enfermedad y por lo tanto representan potenciales nuevos biomarcadores predictivos. Pruebas basadas en sangre periférica es ventajoso porque es relativamente no invasivo y permite el control serial simple. Este artículo describe un método para aislar CD4⁺ las células T de sangre humana y posterior análisis mediante citometría de flujo para enumerar las células cTfh y las proporciones de sus diferentes subconjuntos (cTfhPD-1^{-/ + / hi}, cTfh1, 2, 17 y cTfh1/17). El nivel de estos subconjuntos se comparó entonces entre sujetos normales y pacientes con linfoma. Encontramos que el método era suficientemente robusto como para obtener resultados confiables de material paciente habitualmente recogido. La técnica que describimos para el análisis es adaptable fácilmente a célula clasificación y aplicaciones posteriores como RT-PCR.

Introducción

Linfocitos T folicular (Tfh) son un CD4⁺ subconjunto de células T que fue inicialmente caracterizada en tejidos linfoides¹. Estas células expresan PD-1 y receptores de superficie de CXCR5, secretan IL-21 e IL-4 y expresión nuclear del factor de transcripción, BCL-6^2,3. Como su nombre lo indica, se encuentran en centros germinales y son esenciales para la producción de anticuerpos de alta afinidad¹.

Respuestas de Dysregulated Tfh se han implicado en la patogénesis de la enfermedad, especialmente enfermedades autoinmunes, donde promueven la expansión de las células autorreactivas B⁴. También desempeñan un papel en el microambiente del tumor sólido^5,6 y⁷de cánceres linfoides. Por el contrario, defectos genéticos de proteínas de la superficie esenciales para ESF funcionan como resultado de costimulator (ICOS) de células T inducible en síndromes de inmunodeficiencia humana⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ células en sangre periférica se denominan circulantes linfocitos T folicular (cTfh) y se cree que el compartimiento de memoria de Tfh células en los tejidos⁹. El propósito del método descrito aquí es el análisis de subconjuntos de cTfh siguiendo CD4⁺ aislamiento de muestras de sangre periférica de la célula.

Se han definido varios subconjuntos de cTfh y la eficiencia con la que proporcionan ayuda de la célula de B difiere de un subconjunto a otro^9,10,11,12. Las proporciones relativas de estos subconjuntos se alteran en un número de enfermedades, la mayoría prominente trastorno autoinmunitario en el que hay es casi siempre un aumento relativo en el PD-1 más funcional^{+ Hola} o cTfh2 o cTfh17 los subconjuntos en comparación con los menos PD-1 funcional^– o cTfh1 subconjuntos¹². La magnitud de estos cambios con frecuencia asociado con parámetros clínicos incluyendo títulos de actividad y autoanticuerpo enfermedad, indicando un papel potencial de la distribución de cTfh subconjunto como un biomarcador pronóstico en la enfermedad, que puede reflejar la actividad de ESF en tejidos linfoides^9,12,13,14. Además, tomando muestras de sangre de los participantes es rápida, segura y aceptable y así permite serie de monitoreo para el análisis de progresión de la enfermedad o respuesta a la terapia.

El uso de aislado CD4⁺ las células T sobre suspensiones de células mononucleares (MPC) de sangre periférica tradicional permite experimentos de citometría de flujo de rendimiento más altos, reduciendo el tiempo necesario para adquirir un número considerable de cTfh células para análisis. Esto es particularmente útil cuando clasificación células de cTfh rara subconjuntos utilizando flujo activada (FACS) de clasificación de la célula. Para ayudar a la eficacia, estas suspensiones pueden ser criopreservadas para habilitar la "dosificación" de muestras a utilizar en el experimento de citometría de flujo. En la prueba, el CD4⁺ pureza no se redujo por criopreservación.

Mientras que diferentes laboratorios utilizados diferentes marcadores para categorizar cTfh células en las primeras etapas de su descubrimiento, el método presentaron aquí hace uso de un esquema Unificado de dos grupos de marcadores de superficie celular propuesto por Schmidt et al.^{12, 15} para permitir la identificación simultánea de cTfh y sus subconjuntos reconocidos nueve en una citometría de flujo único experimento.

Como son sólo marcadores de superficie celular, las células no requieren fijación o permeabilización y así pueden permanecer vivas para posteriores estudios funcionales. Esto podría facilitarse mediante clasificación utilizando FACS con el mismo panel de anticuerpos de la célula. Este panel podría ampliarse para incluir otros marcadores, teniendo en cuenta las restricciones del citómetro de flujo se utiliza.

El análisis de experimentos de citometría de flujo de varios colores puede ser difícil debido a la naturaleza inherentemente subjetiva de gating en punto 2 dimensiones de parcelas, sobre todo cuando poblaciones celulares no tienen una distribución bimodal clara en fluorescencia del marcador, como es el caso de las células de la cTfh y sus subconjuntos. Por esta razón, es imprescindible establecer controles efectivos para reducir los artefactos para permitir una mejor resolución de las poblaciones y establecer estrategias que bloquean con confianza. Como tal, diseño del panel de anticuerpos y la puesta en marcha de controles básicos para un flujo cytometry experimentan, es decir, mediante indemnización y FMO controles se detallan en el paso 3.4.2 y 3.4.3,respectively.

Todas las células de la cTfh se definen como CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. El nivel de expresión del marcador característico de activación de Tfh PD-1 se puede determinar entonces identificar los subconjuntos de PD-1^-,⁺ de PD-1 o PD-1^Hola cTfh células. Luego, usando una combinación de los receptores del chemokine CXCR3 y CCR6, que se expresan diferencialmente por Th1 tradicionales 2 o 17 células, cTfh se puede caracterizar como cTfh1, 2 o 17-como por un perfil de CXCR3⁺ CCR6^-, CXCR3^– CCR6^- y CXCR3^– CCR6⁺, respectivamente.

El panel de anticuerpos utilizado en nuestro laboratorio se muestra en la tabla 1. El usuario tenga que adaptar su selección fluoróforo para tener en cuenta el láser y la configuración de filtros de luz disponible en su citómetro de flujo local.

Las siguientes consideraciones influyen en la elección de fluoróforos. Uso de fluoróforos brillante posible. En particular, utilice los fluoróforos más brillantes disponibles en los marcadores más tenue (menos altamente expresados). Marcadores de dimmer incluyen PD-1, CXCR3 y CCR6 y en menor medida, CXCR5. Específicamente hizo uso de la nueva BB, BV y BUV fluoróforos que brindan excelente luminosidad y permitan así una más fácil resolución de poblaciones distintas de las células.

Extender la selección fluoróforo a través de los espectros de emisión tanto como sea posibles reducir al mínimo solapamiento espectral y así el nivel de compensación requerido. Una herramienta gratis, en línea que puede utilizar para ayudar a diseñar un panel de citometría de flujo se puede encontrar aquí: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para ahorrar espacio en el espectro de emisión, se empleó un "canal de descarga" usando un tinte de viabilidad con una longitud de onda de emisión que se superpone con la de APC-H7 (CD45RA conjugado) para permitir la detección y exclusión de ambos muertos o CD45RA⁺ con un solo detector.

Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de la sangre periférica CD4⁺ las células T y su posterior análisis mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de la diferentes y recientemente descrito circulación subconjuntos.

Protocolo

Se obtuvieron muestras de sangre de sujetos normales (NS) (n = 12) así como pacientes con linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) y otros tipos de linfoma no Hodgkin de células B (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma lymphoplasmacytic y 1 bajo grado de células B no especificado linfoma del no Hodgkin paciente). Se reclutaron pacientes de las clínicas de Hematología en el Royal Infirmary de Leicester después de haber informado, consentimiento por escrito, con la aprobación ética en lugar de todos los estudios. Se obtuvo la aprobación ética de Leicestershire, Northamptonshire y 1 Comité de ética de investigación Rutland, referencia 06/Q2501/122 muestras de pacientes y la autoridad de investigación de salud (HRA) NRES Comité East Midlands-Derby, referencia 14/EM/1176 para sujetos normales.

1. aislamiento de CD4⁺ T-células de la sangre entera periférica

1. Tener sangre periférica fresca (2-15 mL) en tubos con EDTA₂K por venopunción estándar y el proceso tan pronto como sea posible para mantener la máxima viabilidad.
   Nota: Utilizar estándar de laboratorio equipo de protección personal (abrigo, guantes, gafas) y llevar a cabo el trabajo en una clase de gabinete de bioseguridad II.
2. Llevar la sangre y los reactivos necesarios (CD4⁺ enriquecimiento cóctel, 2% fetal bovino suero/tamponada fosfato salino (PBS/FBS), medios de gradiente de densidad y congelación medio si la criopreservación de las células) a temperatura ambiente.
3. Mezclar la sangre con un cóctel comercialmente disponible de anticuerpos para el enriquecimiento de humanos CD4⁺ las células de T. Utilizar 50 μl del reactivo por cada 1 mL de sangre. Utilice un tubo de polipropileno cónico de 50 mL por 5 a 15 mL de sangre.
   Nota: Si con 2 a 4 mL de sangre, realizar este paso en un tubo de polipropileno cónica de 14 mL.
4. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5. Diluir la mezcla con un volumen igual de 2% FBS/PBS
6. Capa de esta mezcla diluida en la parte superior los medios de gradiente de densidad poco a poco para evitar molestar a la interfaz y proceder a centrifugación inmediatamente para evitar la difusión de la sangre en el medio de gradiente de densidad.
   1. Para 2 a 3 mL de sangre, use 3 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo de polipropileno cónica de 14 mL, pero para 4 mL de sangre, 4 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo de polipropileno cónico 14 mL y de 5 a 15 mL de sangre , usar 15 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo de polipropileno cónico de 50 mL.
7. Centrifugar la mezcla de capas por 20 min a 1.200 x g con el freno de a 20 ° C.
   Nota: Una temperatura debajo de ambiente puede resultar en la contaminación con eritrocitos y granulocitos. Una velocidad más baja hará que el CD4⁺ proceso de aislamiento al fracaso. Dejando la rotura a disminuirá el rendimiento celular. Utilizar una centrífuga de banco con rotores que pueden cerrarse para evitar aerosoles.
8. Quitar el enriquecido CD4⁺ capa de la célula de la interfaz usando una pipeta Pasteur.
   Nota: La capa de células enriquecido parecerá un estándar "buffy coat" de las células blanco de nublado, pero como sólo CD4⁺ células están presentes, esto naturalmente será más pequeño y más difícil de ver.
9. Agregar 2% FBS/PBS para el CD4⁺ de las células hasta un volumen total de 10 mL y luego lavar dos veces con el 2% FBS/PBS por centrifugación 10 min a 400 x g durante cada ciclo de lavado.
10. Resuspender el precipitado en 2% FBS/PBS y conteo de las células teñidas con un colorante vital (azul de tripán) para determinar el número de células y la viabilidad.
11. Paso opcional: suspender 5 x 10⁵ 1 x 10⁶ células de congelación medio (10% dimetil sulfóxido en FBS) en alícuotas de 1 mL.
    Nota: Pueden alterar los niveles de algunos marcadores de la superficie por criopreservación y descongelación. Por lo tanto, es muy importante que todas las muestras se procesan constantemente. Con el fin de minimizar las diferencias en las variables de análisis, las muestras fueron crio-preservado y por lotes para el análisis en este estudio.

2. citometría de flujo

1. Descongelar los criopreservados CD4⁺ las células rápidamente en un baño de agua a 37 ° C y lavado una vez en precalentado medio (RPMI 1640 + L-glutamina suplementada con 10% FBS y 1 x penicilina-estreptomicina).
2. Añadir las células a 9 mL de medio, centrifugar durante 5 min a 400 x g y eliminar el sobrenadante.
3. Resuspender las células en 1% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (50 μL) para que cada condición a probar utiliza entre 5 x 10⁵ y 1 x 10⁶ células.
4. Las células se mezclan con tampón de tinción (50 μL).
   Nota: Brillante mancha búfer evita que varios artefactos de tinción que pueden interferir con el análisis de los datos cuando dos o más manchas BV o BUV se utilizan simultáneamente debido a inherentes propiedades químicas de estos tintes. En condiciones simples o sin mancha, 50 μl de tampón de tinción brillante puede sustituirse por 50 μl de 1% BSA/PBS.
5. Añadir los anticuerpos a las células (según el "volumen utilizado" columna en tabla 1) e incubar en hielo en la oscuridad durante 30 minutos.
6. Lavan las células dos veces en el 1% BSA/PBS por centrifugación durante 3 min a 600 x g , durante cada ciclo de lavado.
7. Resuspender en 1% BSA/PBS (400 μL) y transfiéralo a un tubo de adquisición de citometría de flujo.
8. Vórtice de las células antes de su adquisición de datos en un citómetro de flujo:

3. instalación y controles de citometría de flujo

1. Utilizando una muestra sin manchas, conjunto fotodiodo voltajes para que los linfocitos pueden ser separados de la obvia suciedad y células muertas (eventos con área de scatter (SSC) lado de alta y baja forward scatter (FSC))¹⁶. Utilizando solo teñido de muestras, establece fotomultiplicador voltajes (PMT) para que fluorescencia positiva se puede discernir de la fluorescencia del fondo asegurándose de que todos los eventos de caída dentro de la escala perceptible.
   Nota: Una mejora sería la trama CV contra voltaje PMT por cada PMT usando granos débilmente fluorescentes para encontrar la tensión mínima para una resolución óptima ("El pico 2" método¹⁹).
2. Cuenta de superposición espectral mediante la generación de una matriz de compensación con manchas solo captura de cuentas. Añadir granos de compensación disponible comercialmente (60 μL) y los granos de control negativo (60 μL) a 1% BSA/PBS (100 μL) y de vórtice.
   Nota: Los granos de captura utilizados deben coincidir con la especie hospedadora y el isotipo IgG del anticuerpo se utiliza. La matriz de compensación debe ser re calculada si el número de lote de cualquier tándem tintes cambios, pueden mostrar una variabilidad considerable en sus espectros de emisión entre lotes.
3. Agregar un solo anticuerpo (20 μl) y vortex.
4. Incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos.
5. Centrifugue a 200 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.
6. Resuspender en 1%BSA/PBS (500 μl) y vortex.
7. Tomar la muestra con un citómetro de flujo utilizando el generador de la matriz de compensación señalado en el software de adquisición de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
8. FMO controles para guiar la colocación de puertas de fluorescencia del marcador positivo para tener en cuenta para el derrame del colorante, que es la fuente principal de la fluorescencia de fondo en los experimentos con ≥4 colores¹⁶. Siga la tinción de superficie de la célula general del protocolo que se describe en el paso 3, pero para cada condición, omite uno de los fluoróforos en el paso de tinción (donde se omite el CD45RA, también omite la mancha en vivo/muerto). Adquirir 100.000 linfocitos para cada condición.
9. Establecer la positividad de la puerta en el ≤0. 5% de las células. Vea la figura 2 para un ejemplo ilustrado de FMO controles.

4. Análisis de datos

1. Emplear el software de adquisición de citómetro de flujo para definir un umbral de 5.000 unidades en el parámetro FSC para excluir residuos muy pequeños.
2. Utilizar una puerta parar adquirir 10.000 células cTfh (CD4⁺ CD45RA^– CXCR5⁺).
   Nota: El usuario puede recoger más de 10.000 células. Este número fue un compromiso entre la recolección de suficientes células para proporcionar resultados significativos y el tiempo tomado para la colección.
3. Un área de FSC / SSC-zona punto, dibujar una elipse o polígono puerta para seleccionar la población de linfocitos, mientras que excluyendo desechos y células abiertamente muerto (eventos con SSC-zona alta y zona de FSC bajo).
4. Un área de FSC cierre parcela de FSC-anchura punto, dibuje un polígono para seleccionar las células mientras que excluyendo dobletes (dobletes tienen un área mayor pero de anchura similar a las células).
5. Un área de FSC / marcador CD45RA y viabilidad punto trama, dibujar una puerta rectangular para seleccionar vivo, CD45RA^– (células con una leve fluorescencia para este marcador).
6. Un área de FSC / CD4 punto trama, dibujar una puerta rectangular para seleccionar CD4⁺ (células con una alta fluorescencia de este marcador).
7. Con un CD4 / CXCR5 punto trama, dibujar una puerta rectangular para seleccionar CXCR5⁺ (es decir, cTfh) (células con una alta fluorescencia de este marcador).
8. Usando un CXCR3 CCR6 trama de punto, coloque una cuádruple puerta subdividir cTfh células en cTfh1, 2 y 17 (células que son alta y baja para cada marcador).
   Nota: Las células con el fenotipo CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺ estan mal caracterizado. Nos referimos a estas células como cTfh1/17¹⁸ porque convencional linfocitos T colaboradores (CD4⁺ CXCR5^–) que están haciendo una transición entre Th17 y Th1 Mostrar expresión de CXCR3 y CCR6 y han sido descritos como cTfh1/17¹⁹.
9. Usando un histograma de PD-1, utilice la herramienta de la gama para subdividir las células cTfh (o si se prefiere, el cTfh1 individual, subconjuntos 2, 17 o 1/17) en PD-1^{-/ +} u ^Hola poblaciones.
   Nota: La distinción entre PD-1⁺ y PD-1^Hola no está bien definida en la literatura. El umbral se establece como la misma intensidad de PD-1 necesaria para detectar Tfh bona-fide en suspensiones de linfocito humano amígdala mediante citometría de flujo con el mismo panel de anticuerpos. Alternativamente, un marcador para el OCI puede añadirse al panel de anticuerpos, como sólo PD1^Hola células son ICOS⁺.

Resultados

Alta CD4⁺ pureza fue alcanzada usando el CD4⁺ protocolo de aislamiento, que era confiable a través de todas las muestras de sangre probados por nosotros (significa: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (figura 3).

Identificación de cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ células) en un sujeto normal representativo se presenta (figura 4A). L...

Discusión

Este protocolo representa una manera simple y eficaz para analizar las células de cTfh de sangre periférica, lo que permite la detección de todos los subconjuntos relevantes identificados en la literatura hasta el momento. Muestras de sangre pueden fácilmente y eficientemente obtenerse como parte de estándar pacientes clínicas y muestras seriales se puede recoger en paralelo con los datos clínicos. A su vez, esto permite estudios prospectivos evaluando la cTfh subconjuntos como biomarcadores de progresión de la e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973